三分子荧光互补系统构建及活细胞内流感病毒mRNA-蛋白相互作用可视化研究

活细胞内mRNA-蛋白质相互作用可视化监测可以原位实时地解析这一生物学基本过程，是极具前景的新技术。mRNA介导荧光蛋白双片段互补即三分子荧光互补的概念是实现活细胞内mRNA-蛋白质相互作用可视化的新思路。基于我们前期建立的性能优越的mCherry双分子荧光互补系统，结合HIV REV-RRE、TAT-TAR等肽段-RNA序列的组合，本研究拟构建一种基于mCherry的新型三分子荧光互补系统，发展活细胞内mRNA-蛋白质相互作用可视化新方法，并把该方法应用于甲型H1N1流感病毒mRNA-蛋白质相互作用的活细胞内可视化研究，筛选与甲型流感病毒三种不同类型mRNA有相互作用的病毒蛋白和细胞蛋白，可视化分析流感病毒mRNA的出核过程，解释流感病毒mRNA选择性出核控制机理。本研究的开展，将发展活细胞内mRNA-蛋白质相互作用影像新技术，并深入解析流感病毒mRNA核质转运机制，具有重要的学术意义。

本研究基于mCherry双片段荧光互补系统，结合HIV REV-RRE、TAT-TAR等肽段-RNA序列相互作用组合，首次构建了一种红色mCherry三分子荧光互补系统，发展了可用于活细胞内mRNA-蛋白质相互作用可视化新方法。该方法用于在活细胞内可视化观察流感病毒NS1蛋白与NS 5’UTR, M 5’UTR，NP 5’UTR等mRNA序列之间的相互作用，证明mCherry三分子荧光互补系统是可视化研究mRNA-蛋白质相互作用的有力工具。进而，mCherry三分子荧光互补系统用于甲型H1N1流感病毒mRNA与宿主细胞内mRNA出核TAP途径相关蛋白相互作用可视化研究，发现UAP56、Aly、hnRNPA1等宿主蛋白与流感病毒三种不同类型的mRNA，包括不含内含子不需要剪接的NP mRNA，含内含子需要剪接的M2 mRNA，含内含子不需要剪接的NS1 mRNA之间均有相互作用，而细胞蛋白9G8只与含内含子需要剪接的M2 mRNA有相互作用，揭示了流感病毒mRNA选择性出核的重要机理。同时，将单体红色荧光蛋白mNeptune开发为一种远红光的双分子荧光互补系统。并进一步构建了基于mNeptune的远红光三分子荧光互补系统，检测了活细胞及活体内蛋白质-RNA的相互作用。利用mNeptune-TriFC系统，首次发现了PTB与HIV-1 3’LTR之间的相互作用，在HIV-1 mRNA的出核机制研究方面取得重要进展。部分相关结果已在SCI源刊Biosens Bioelectron和PLoS ONE发表论文3篇，国际重要会议邀请或口头报告3次。