肠道菌群在肠道感染和应激致内脏高敏感中的作用及机制研究

Visceral hyperalgesia is an important feature of abdominal pain in patients with irritable bowel syndrome. Many studies indicated that visceral hyperalgesia was increased by imbalance of intestinal flora, however, the specific mechanism was unknown. Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) is closely related to visceral pain perception, and involved in enteric nerve response induced by some special intestinal bacteria. The activation of presynaptic TRPV1 can increase the release of excitatory neurotransmitter glutamate, which largely depends on the activity of vesicular glutamate transporter-3(VGLUT3). Therefore, we assumed that imbalance of intestinal flora can activate TRPV1 channels, which induced more VGLUT3 activity and the subsequent release of the neurotransmitter glutamate, resulting in the formation of visceral hyperalgesia. This study will be the first time to explore the effects of intestinal flora on TRPV1-VGLUT3 pathway of peripheral and central nervous system in vivo and ex vivo, which will be helpful in make new ideas and insights on visceral hyperalgesia.

内脏高敏感是肠易激综合征患者腹痛的重要特征。研究提示肠道菌群失调能增加内脏高敏感性，但机制不明。瞬时感受器电位香草酸受体1 （transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）与内脏疼痛感知密切相关，且一些特殊肠道菌属很大程度上通过TRPV1通道参与肠扩张引起的肠神经反应。神经突触前TRPV1的激活能增加兴奋性神经递质谷氨酸的释放，而谷氨酸的释放取决于囊泡谷氨酸转运体-3（vesicular glutamate transporter-3，VGLUT3）的活性。因此本研究假设肠道菌群失调可能激活TRPV1通道，诱导VGLUT3活性增强及随后谷氨酸的释放，导致内脏高敏感的形成。本研究将首次通过体内外实验探讨肠道菌群对外周和中枢神经TRPV1-VGLUT3通路的影响，对内脏高敏感的研究提出新的思路和见解。

研究背景:.肠易激综合征（IBS）在胃肠门诊病人中占到将近40%。目前关于IBS腹痛的发病机制仍不是完全清楚，且临床上无有效的治疗方法。研究表明肠道菌群在IBS发病过程中扮演着重要作用，另外前期研究表明TRPV1和VGLUT在内脏高敏感中扮演者重要的作用。因此本研究的目的是探讨肠道菌群是否通过TRPV1-VGLUT通道减轻大鼠的内脏痛觉过敏。.研究方法:.1. 动物分组和慢性避水应激模型的制备：大鼠随机分为应激组、对照组和利福昔明+应激组。.2. 内脏运动反应检测和肌电图资料分析：以BL-420生物机能实验系统收集并分析信号。.3. 免疫荧光法：L6S1的DRG取材后。DAPI封片后于激光共聚焦显微镜下采集图像并行定量检测分析。.4. 蛋白质印迹法：将大鼠麻醉后处死，快速分离L6S1段脊髓，进行相关蛋白定量检测。.5. 16S rDNA序列分析：大鼠新鲜粪便分离微生物基因组DNA，对DNA的16S V3-V4区进行PCR扩增。使用illumina HiSeq PE250进行上机测序。.重要结果及数据.1. 扩张容积为0.1、0.4 mL时，各组间EMG相比无明显差异。扩张容积为0.2、0.3 mL时，WAS组EMG均显著高于对照组，利福昔明组又显著低于WAS组。.2. 免疫荧光法显示，与对照组相比，WAS组大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫活性信号明显增强。但与WAS组相比，利福昔明给药能明显减少TRPV1和VGLUT2/3的免疫活性信号。以TRPV1拮抗剂预处理后，大鼠L6S1 DRG中VGLUT2/3免疫活性明显降低。.3. 蛋白质印迹法显示，与对照组相比，WAS组L6S1脊髓段中TRPV1和VGLUT2/3蛋白表达明显增加。与WAS组相比，利福昔明组TRPV1和VGLUT2/3蛋白表达明显减少。.4. 利福昔明组、WAS组和对照组大鼠肠道菌群有明显差异性。Alpha多样性分析结果显示，与对照组相比，WAS组Shannon指数明显降低；利福昔明组显著高于WAS组。说明利福昔明可改善WAS诱导的肠道菌群紊乱。.科学意义.利福昔明可减轻WAS诱导大鼠的内脏痛觉过敏，降低L6S1 DRG和脊髓神经元的TRPV1表达。利福昔明可部分抑制肠道菌群相对丰度的降低。对照组大鼠接受FMT后，肌电活性和TRPV1免疫反应性发生改变。.