Hedgehog信号通路调控宫颈癌上皮间质转化的作用及机制

Hedgehog(Hh)信号通路的过度激活会提高肿瘤细胞的侵袭性，其作用机制可能与上皮间质转化（EMT）有关。我们的前期研究发现Hh信号通路在宫颈癌组织异常激活,该通路抑制剂能有效抑制宫颈癌细胞的增殖、移动和转移能力；而且EMT的转录因子Twist1在宫颈癌组织高表达。但Hh信号通路调控宫颈癌EMT的作用及分子机制尚不清楚。本项目在此研究基础上，采用基因转染和siRNA干扰技术，结合RT-PCR、Western Blot、免疫组化染色、免疫荧光染色、Transwell迁移实验和基因芯片分析等方法，研究Hh信号通路调控宫颈癌细胞EMT的作用及分子机制，阐明逆转宫颈癌EMT对Hh信号通路靶向基因表达的影响，分析Hh信号通路调控宫颈癌EMT的基因网络，将有效地揭示Hh信号通路调节宫颈癌侵袭转移机制，为宫颈癌的临床诊断、预后判定和靶向治疗找出新靶点，具有潜在的临床应用价值。

Hedgehog(Hh)信号通路的过度激活将会提高肿瘤细胞的侵袭性，其作用机制可能与上皮间质转化（EMT）有关。本项目首先采用免疫组化染色方法，在宫颈癌组织观察Hh信号通路因子shh、Gli-1和Gli-2及EMT关键转录基因Twist1的表达，并用Hh信号通路的smo抑制剂cyclopamine抑制宫颈癌HeLa细胞中的该通路后，结合RT-PCR、Western Blot、Transwell迁移实验等方法，研究Hh信号通路调控宫颈癌细胞EMT的作用及分子机制。在宫颈癌组织 Shh、Gli-1和Gli-2的阳性率在HPV16阳性组显著高于阴性组；Smo的阳性率在淋巴结转移组显著高于非转移组。Twist1蛋白在宫颈癌组织的表达率明显高于正常宫颈粘膜组织，而且Twist1呈阳性的患者5年生存率明显低于阴性者。对Twist1的启动子区进行了生物信息分析，发现Twist1基因的大部分启动子区域存在同源性，其同源性序列中集中在 E2, CP2A, FXR, MAX, MYB, ATF6等转录因子结合部位。当cyclopamine剂量从5uM增加至100uM 时，随着药物剂量的增加，Hela细胞生存率逐渐下降，且cyclopamine抑制作用逐渐增强。利用双层软琼脂克隆形成实验显示，10uM和20uM cyclopamine组细胞集落个数显著少于对照组软琼脂中的集落个数。各时间段cyclopamine组HeLa细胞的Gli-1 mRNA表达水平明显低于对照组，随着cyclopamine浓度的增加Gli-1和Slug的mRNA及蛋白表达量逐渐下降。划痕实验结果示：与对照组相比cyclopamine组细胞划痕经36h培养仍未愈合。Transwell迁移小室实验结果示：用药处理48h后cyclopamine组迁移和侵袭到小室的细胞数明显少于对照组。通过本项目的研究有效地揭示了Hh信号通路调节宫颈癌侵袭转移机制，为宫颈癌的临床诊断、预后判定和靶向治疗找出了新靶点。