自噬-凋亡在低氧性肺动脉高压自然逆转中的作用及分子机制研究

Exact mechanism of hypoxic pulmonary hypertension (HPH) characterized by pulmonary vasoconstriction and pulmonary vascular remodeling is not clear. It should have considered that happened pulmonary artery remodeling in HPH is difficult to restore, and the latest studies show that is a misunderstanding. The thickened pulmonary vascular wall and increased pulmonary arterial pressure can be reversed after recover oxygen. However, the molecular mechanisms of reversing pulmonary vascular remodeling were known very little. We hypothesis that pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) happened autophagy in low oxygen is the basis of HPH natural reversed. The cell happed autophagy，especially excess autophgy must not be rehabilitation immediately after recovery oxygen, which changes in ROS generation and accelerates cellular apoptosis, so promotes the reversal of HPH. Given the effects of AMPK and mTOR on cell proliferation, and energy metabolism, and our earlier experimental results that Skp2 plays an important role through regulating P27 to facilitate proliferation and inhibit apoptosis of PASMCs,the project intends to observe the dynamic changes of pulmonary vascular remodeling and PASMCs autophagy and apoptosis, and the role of ROS/AMPK/mTOR /Skp2 in HPH natural reversed from animal and cell level. The project would provide new clues and ideas from new perspective for underlying mechanism and control HPH.

以肺血管收缩和肺血管重建为特征的低氧性肺动脉高压（HPH）的确切机制尚不清楚，曾认为HPH时发生的肺血管重建是难以恢复的，最近研究证明纠正低氧后增厚的肺小血管壁和增高的肺动脉压是可以逆转的，但其分子机制所知甚少。我们认为在低氧期肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）发生的自噬是导致复氧后HPH自然逆转的基础，发生自噬尤其是过度自噬的细胞在复氧后不能迅速再适应, 从而导致ROS生成改变加速细胞凋亡，促使HPH的逆转。鉴于AMPK和mTOR对细胞增殖、能量代谢等方面有重要调节功能，结合我们前期已经证明Skp2通过调节P27进而促进PASMCs增殖和抑制凋亡中的重要作用，本项目拟从动物和细胞水平动态观察复氧后肺血管重建和PASMCs自噬、凋亡的动态变化，并从ROS/AMPK/mTOR/Skp2入手探讨HPH自然逆转的分子机制，从新的视角研究HPH的发生发展机制，为防治HPH提供新的线索和思路。

低氧性肺动脉重构作为低氧性肺动脉高压（HPH）最显著的病理改变，是肺动脉压力持续升高的重要因素。近年来有大量研究表明，恢复常氧后，低氧性肺动脉重构可逐步逆转。复氧期“细胞死亡”与“细胞增殖”间平衡的动态变化，将是影响肺动脉重构逆转的关键因素。那么在低氧性肺动脉重构复氧逆转的过程中，究竟是“细胞死亡”还是“细胞增殖”的改变导致了肺动脉重构的逆转，目前尚不清楚。. 本研究项目在整体和细胞水平分别采用TUNEL染色、免疫组化检测，Western blotting，DCFH-DA及MitoSOX Red荧光染料等方法探讨低氧性肺动脉重构在恢复常氧条件后的改变，及其发生的相关机制。. 研究结果显示： RVSP 、RV/(LV+Sep)、MT%及MA%等与HPH功能及结构相关的指标，在HPH大鼠被转至常氧条件后，可逐步逆转。与低氧组相比，复氧显著增加了中膜PASMCs凋亡，而降低了其自噬及增殖水平。此外，复氧使肺组织中H2O2的水平显著升高。低氧48 小时显著促进PASMCs的生长；当低氧48 小时后复氧24小时，可见PASMCs的生长率与常氧组相比显著减慢。复氧期PASMCs的凋亡及增殖水平均较常氧组显著升高，但凋亡增加的更为显著。复氧期PASMCs的自噬水平与常氧组无显著差异。复氧阶段，PASMCs内总的ROS及mROS均显著升高；应用了NAC和MitoTEMPO后，总的ROS和mROS几乎同等程度地降低, 同时，可见复氧期PASMCs的凋亡被显著抑制。 低氧期使用Chloroquine（自噬抑制剂）干预后复氧24 h, PASMCs复氧期凋亡减少。复氧期，PASMCs线粒体膜电位显著降低、线粒体ATP合成功能明显受损，再者线粒体膜间空间的Cyto C大量释放至胞浆。清除了PASMCs中ROS及mROS后，线粒体的膜电位、通透性水平以及ATP合成能力，基本恢复至正常水平。. 上述结果可以得出如下结论：低氧性肺动脉高压特征性病理改变低氧性肺动脉重构，在恢复常氧条件后，可以逐步得到缓解，且PASMCs特异性的凋亡参与了此过程。复氧阶段PASMCs内大量产生的ROS，尤其线粒体来源的ROS，诱发的线粒体损伤，最终启动了PASMCs内源性凋亡程序。低氧期的过度自噬是复氧期PASMCs凋亡的原始动力。