2型糖尿病伴牙周炎牙周膜干细胞凋亡转归的线粒体损伤、自噬失调机制研究

PDLSCs plays an important role in development of periodontitis with diabetes mellitus. Disease may result in PDLSCs mitochondria damage and autophagy disfunction invoving JNK pathway. Our previous research results showed that the AGEs inhibited the proliferation of PDLSCs and decreased its osteogenic capacity. Meanwhile, the osteogenic capacity of PDLSCs in patients with type2 diabetes mellitus was the lowest.And ROS and the quantity of autophagosome level were increased in specific microenvironment, finally caused high level of apoptosis. The aim is to observe the cells mitochondria, autophagy, proliferation and differentiation in PDLSCs between periodontitis and periodontitis with type2 diabetes mellitus, to determine the effects and mechanisms of AGEs and TNF-α for imitating the microenviroment of diabetes mellitus and periodontitis on JNK signaling pathway of PDLSCs. Detecting the effects of AGEs on mitochondria, autophagy, apoptosis, proliferation and differentiation through intervening JNK signaling pathway. We continue to determine the effects of AGEs on JNK signaling patyway in vivo again. We hope to provide the experimental basis for illustrating the development mechanism of periodontitis with type2 diabetes mellitus and the therapeutic application of stem cells.

2型糖尿病伴牙周炎发生发展中牙周膜干细胞扮演着重要的角色，疾病可能通过影响PDLSCs线粒体功能及自噬稳态导致细胞凋亡，JNK信号通路可能参与其中。前期研究表明，AGEs可能抑制PDLSCs的增殖、骨向分化能力，并抑制WNT信号通路，糖尿病伴牙周炎患者PDLSCs成骨分化能力最低，ROS在糖尿病伴牙周炎微环境下具有较高生成水平，并且其自噬小体数目较多，最终可能导致PDLSCs凋亡程度升高。观测2型糖尿病伴牙周炎患者PDLSCs线粒体损伤、自噬、凋亡和增殖、分化性能改变；明确AGEs和TNF-α联合作用对PDLSCs的JNK的作用及其可能的分子作用机制；AGEs对PDLSCs线粒体损伤、自噬、凋亡、增殖和成骨分化的干预作用方式及相关机制；体内验证JNK对2型糖尿病伴牙周炎来源的PDLSCs成骨分化作用，进一步明确AGEs及AGEs介导的PDLSCs的线粒体改变、自噬失调对成骨分化的影响。

2型糖尿病与牙周炎密切相关。但2型糖尿病伴牙周炎发生、发展的分子机制目前仍不甚清楚。前期研究表明，牙周膜干细胞（PDLSCs ）在该疾病发生发展中可能发挥重要作用。为此，调控 2 型糖尿病伴牙周炎状态下PDLSCs JNK 信号通路，来逆转细胞的氧化应激、自噬失调对PDLSCs 凋亡及相关生物学性能的影响是本项目研究的目标。.研究内容：1、对比观察健康者、牙周炎患者和 2 型糖尿病伴牙周炎患者PDLSCs 线粒体的差异、增殖分化能力及细胞自噬情况。2、AGEs 和AGEs 与 TNF-a 联合体外刺激健康 PDLSCs，检测 JNK 通路相关基因（c-jun）及线粒体呼吸及细胞凋亡相关基因（P53, Bcl2, c-mys）的细胞水平，活性水平和细胞定位，并进行 ROS 的表达和自噬的检测。3、利用 RAGE(sRAGE)、JNK 信号通路抑制剂/激动剂逆转或增强 AGEs 对 PDLSCs 线粒体的影响，对比分析 PDLSCs 的 ROS和线粒体呼吸链相关基因表达水平，明确干预后的牙周膜干细胞骨向分化能力的变化。同时，以糖尿病伴牙周炎患者来源的 PDLSCs实验数据加以佐证，进一步探索 2 型糖尿病状态和 AGEs 以及 AGEs 与 TNF-a 联合作用对 PDLSCs线粒体损伤、凋亡、自噬及其对 JNK 信号通路的影响。.重要结果：1、AGEs和TNF-α均能抑制PDLSCs的增殖活性和骨向分化能力，AGEs较TNF-α更重。TNF-α和AGEs能诱导PDLSCs生成内源性ROS，导致PDLSCs氧化损伤，激活JNK信号通路，触发线粒体介导的内源性细胞凋亡途径及调控Bax和Bcl-2的表达，诱导PDLSCs发生凋亡。2、牙周炎、2型糖尿病和2型糖尿病伴牙周炎患者PDLSCs 的增殖和多向分化能力下降。诱导PDLSCs生成大量ROS诱发细胞发生氧化损伤。2型糖尿病伴牙周炎患者PDLSCsJNK被磷酸化激活，发生自噬失调和细胞凋亡。3、使用SP600125处理细胞后，各组细胞的caspase-3表达随JNK磷酸化水平的降低而减少，骨向分化能力一定程度恢复。..关键数据及其科学意义：1、AGEs和TNF-α通过氧化应激产生内源性ROS，使PDLSCs性能减弱或丧失。通过激活JNK信号通路触发线粒体介导的内源性细胞凋亡途径，诱导PDLSCs发生凋亡。2、2型糖尿病伴牙