胞外活性物对铜绿假单胞菌NY3烷加氧酶基因功能的影响作用

Remediation technology is in urgent need for the challenging environmental problems caused by petroleum contamination. Microbial technology is considered to be effective and safe. Pseudomonas aeruginosa，ubiquitous in nature, strong adaptability, and with ability to utilize widely carbon and nitrogen sources, is a suitable candidate of bacterial genus for oil-spill clean-up. Pseudomonas aeruginosa NY3 strain is one of the most effective strain for oil pollution clean-up so far, and is honored as "oil eater" by medium. This project proposal will study on such three factors as the alkane hydroxylase genes, the pyocyanin as a redox-active species, the emulsifying action of rhamnolipid and their interreaction relationship involved in hydrocarbon degradation by Pseudomonas aeruginosa NY3 strain. The study include: the functions of alkB1 and alkB2 genes; the spatial-temporal-quantitative patterns of the gene expressions, and the catalytic carbon spectrum of the corresponding enzyme; the actions of extracellular pyocyanin on hydrocarbon oxidation by NY3 strain; the effects of coexisting pyocyanin and rhamnolipid on the functions and catalytic carbon spectrum of alkB genes; the condition optimization of hydrocarbon oxidation under alkB high-level expression will carry out; characteristic of material flow during hydrocarbon oxidation will also be studied for avoiding secondary pollution. This study will lay foundation for NY3 strain application to oil polluted environmental remediation, to dredging the pipeline blocked by oil waste, and to the synthesis of special drugs.

原油污染是人类面临的重大环境问题之一。迫切需要相应修复技术。微生物修复技术是有效而安全的。铜绿假单胞菌广泛存在于环境中，适应性强，能利用的碳、氮源广，是好的除油候选菌属。铜绿假单胞菌NY3，是目前发现的除油速度最快的菌株之一，被誉为"吃油菌"。项目拟利用分子生物学和化学手段，围绕NY3菌烃代谢反应中，烷加氧酶基因、胞外吩嗪类和鼠李糖脂等小分子活性物及其作用展开研究。研究包括：NY3菌alkB烷加氧酶基因功能、基因表达时间特征和降解底物谱；研究吩嗪类物质参与烃氧化反应的条件和机理及其对alkB基因表达时间特征和降解底物特征的影响；研究鼠李糖脂及其与吩嗪类共存时，对NY3菌降解底物谱及对alkB基因表达的影响；烷加氧酶基因alkB高表达条件下，优化NY3菌烃降解条件，掌握碳氮源代谢物质流向特征，避免造成二次污染。研究将为NY3菌在原油污染环境修复、油污堵塞管道清除等方面的应用奠定基础。

以气-质谱、飞行时间质谱、扫描电镜、气相色谱、电子顺磁共振波谱、紫外光谱等为分析手段，结合各种分子生物学研究方法，本项目研究了铜绿假单胞菌NY3烷氧化酶基因功能；研究了吩嗪类、绿脓杆菌敖铁蛋白、小分子有机酸及鼠李糖脂等四类胞外活性分泌物在NY3菌对烃降解的促进及其作用机理；优化了NY3菌油污泥处理综合条件，建立了NY3菌处理高浓度含油废水新工艺。.研究发现：alkB2基因表达是伴随细胞生长整个过程，而alkB1基因则是在诱导存在下方可表达的，alkB1 和 alkB2基因主要负责C12 到 C18或更长烷烃碳链的代谢。在真核表达载体pPIC9K上构建重组质粒，转化毕赤酵母表达菌株KM71，能实现AlkB1和AlkB2的胞外表达。.首次发现NY3菌分泌的1-羟基吩嗪（HPE）、绿脓菌素（Pyo）、吩嗪-1-酰胺（PCN）、吩嗪-1-羧酸（PCA），与胞外烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或谷胱甘肽（GSH）降解配合，能以自由基机理降解并促进烃类污染物。首次发现NY3菌分泌的两个手性异构绿脓杆菌螯铁蛋白（PCH）与胞外液中Fe3+配合，能以所产的羟基自由基进一步降解烃类污染物。 胞外积累的小分子酸能促进NY3菌细胞生长，其中共存戊二酸能上调了alkB1和alkB2表达，提高NY3菌细胞中NAD+/NADH比值、加快氧化还原电子传递速度，明显促进NY3菌降解烃类物质，而草酸与戊二酸相反，共存草酸并不利于细胞生长和关键酶的表达，但其可通过提高胞外PCA的分泌量，并与胞外NADH或GSH配合产生超氧负离子、过氧化氢，使烃降解率提高约26-28%。.鼠李糖脂可通过改变疏水性污染物传质方式及其细胞生理生化特性，而提高细胞活性，进而促进烃类降解，能提高油污泥的处理效率，尤其是蜡质油污泥中的长链烃去除率。.铜绿假单胞菌NY3细胞固定化于聚氨酯泡沫（PUF）表面，生物量最高可达458.76 mg干菌/g PUF。在水力停留时间为4-8h可处理70-2000mg/L的含油废水，去除率保持在90-95%。运行后生物膜活性可恢复。.本项目研究工作为中长碳链烷氧化酶结构及活性中心研究奠定基础，开辟了胞外自由基反应降解污染物的研究方向，为NY3菌在污染物处理工程中的应用奠定了基础。