铜绿假单胞菌胞外聚合物性质及功能的高通量原位研究

Extracellular polymeric substances (EPS)，which forms the scaffold for the three-dimensional architecture of the biofilms and is responsible for adhesion to surfaces，plays distinctive and essential role in the forming and development of biofilms. However, the in situ methods that can be applied to characterize the properties or the functions of EPS are rather limited, which results in that the current studies of EPS cannot elucidate the underlying mechanism that determines biofilms formation. Here, by using a combination of molecular microbiology, microfluidics and state of the art microscopical techniques, first, we propose a complete solution that can 1) in situ visualize the adherent surface of bacteria, and characterize the microrheology of the bacterial slime layer, and quantitatively measure the adherent or friction forces between the bacteria and the surface; 2) in situ monitor the secretion of EPS, and map the spatial distribution of EPS on surface; 3) in situ track attaching, detaching, moving and clustering of bacteria on surface. Second, we will systemically investigate the interrelatedness among the bacterial surface behaviors, the properties as well as the functions of EPS during the Pseudomonas aeruginosa biofilms formation, thus eventually elucidating the roles played by EPS. Finally, we will seek new strategies that can be used to control the surface behaviors of bacteria by using the particular surfaces that are designed for impairing the normal functions of EPS.

胞外聚合物的分泌是细菌生物被膜形成的必要条件。它的性质和功能与生物被膜的形成机制紧密相关。由于缺少原位表征胞外聚合物性质和功能的方法，导致现今的研究基本和生物被膜形成的机制脱节。因此, 我们拟通过将分子生物学、微流控技术和多种显微镜手段结合，给出一整套的高通量解决方案以便在生物被膜形成过程中，1)定量表征细菌表面粘附的微观状态和胞外聚合物在细菌和表面间产生的粘附力、摩擦力以及胞外聚合物的微流变性质；2)实时监测胞外聚合物中特定物质的分泌和其在表面上的分布；和 3)定量研究细菌在表面上的粘附、运动、脱附和聚集行为。利用所建立的全新方法，我们将以铜绿假单胞菌为模型在其生物被膜形成的中前期定量研究它所分泌胞外聚合物的性质、功能和细菌行为之间的内在关联，从而在机制上阐明胞外聚合物所行使的功能。希望通过掌控的规律来设计和制备能干扰胞外聚合物性质和正常功能的表面，从而探索控制细菌表面行为的新方法。

生物被膜的形成将导致多种难以用抗生素治疗的急、慢性感染，从而严重威胁人类的健康。细菌在表面上的初始粘附是生物被膜形成的必要条件。在此大背景下，我们系统的研究了在生物膜形成的初期过程中和细菌粘附行为密切相关的两个主题。在第三个主题中，我们还进一步地发展了瓦解细菌生物被膜形成的新策略。植介入性医疗器械的广泛使用会大幅增加相关感染的可能性。在这类感染发生的过程中，细菌在这些医疗机械表面的初始粘附以及在流场剪切下如何保持粘附的机制仍不清晰。在第一个研究主题中，我们通过系统的研究发现在铜绿假单胞菌中存在一种异化表型，处于这中表型的细菌可粘附在多种高分子材料表面且可抵抗强流场的剪切。由这种抗强流剪切表型细菌所形成的生物被膜对于氨基糖苷类抗生素的耐受性显著强于普通表型细菌所形成的生物被膜。进一步的研究表明：铜绿假单胞菌是通过过表达胞外蛋白CdrA去交联胞外多糖Psl形成Cdr-Psl复合体，从而实现细菌对多种高分子材料表面的抗强剪切的粘附，据估算粘细菌与基底的附强度可达50 N/mm2。抗强流场剪切的粘附细菌的发现以及其表面粘附机制的阐明为生物医疗器械使用介导的细菌感染性疾病的防治提供新的理论基础，具有非常重要的临床应用价值。处于对数生长的浮游状态菌群通常被认为处在生理以及表型均一的状态。在第二个研究主题中，通过结合高时空分辨的显微镜与单细菌追踪技术，我们却发现处在对数生长期浮游的铜绿假单胞菌在表面粘附时存在显著分化，即：约有80%的细菌可在15分钟内完成对表面的快速粘附，而剩下20%的细菌只缓慢的粘附于表面。进一步地研究发现：1）细菌快慢表面粘附的分化是由细菌生产、分泌胞外多糖Psl分化所导致的；2）生产、分泌胞外多糖Psl分化是由RsmYZ/RsmA 基因调控回路所控制。 我们的研究还发现，快慢粘附表型的分化会进一步的影响后续细菌生物被膜的形成。在第三个研究主题中，我们利用合成生物学的思路去探索细菌生物被膜防治的新策略。在这个研究主题中我们首先将蓝光激活磷酸双组份系统整合入了铜绿假单胞菌的基因组。我们首先在铜绿假单胞菌中完成利用蓝光对绿色荧光蛋白表达的精确控制的测试。然后我们利用该系统控制磷酸二酯酶PA2133在菌中的表达从而实现利用蓝光控制第二信使分子环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的目的。通过对c-di-GMP的调控。我们实现了利用蓝光的辐照阻止细菌生物被膜形成的目的。