糖尿病状态下天然免疫信号活化促进肾细胞表型转化和肾纤维化作用及机制

Diabetic nephropathy（DN）is one of the main cause of end stage renal failure. However, the pathogenesis of DN is not completely understood so far. Recently, ourself and other studies demonstrated that under high glucose and angiotension conditions, the upregulation of Toll like receptor 4(TLR4) in renal tissue may result in inflammatary response and nephrosclerosis. Upon these findings, scholars prefered that type 2 DN is an “innate immune disease”, the innate immune mechanism of renal fibrosis remains to be under active consideration. The aims of this study were to explore the roles of TLR4 adaptor-myeloid differentiation factor 88 (MyD88) dependent pathway and intracellular innate immune receptor-NOD-like receptor P3(NLRP3) as well as collagen molecular chaperone--heat shock protein 47(HSP47) in the renal fibrosis progression of DN by means of observing the inflammation and fibrosis-related factors’ expression in type 2 DN model；high glucose cultured mesangial cell; tubular epithelial cell as well as human renal tissue of type 2 DN; further to elucidate the relation-ship between MyD88、NLRP3 signal and the extracellular matrix(ECM) remolding as well as renal cells’ phenotypic transformation; revealing the novel mechanism of innate immune responses and regulations in the renal fibrosis progression of DN, which may have new clinical implications and key targets in the prevention and treatment of this disease.

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是导致终末期肾脏病的重要病因，其机制尚不完全清楚。前期研究发现，高糖状态下肾组织天然免疫受体TLR4表达异常与肾硬化存在密切关系。本项目旨在通过2型DN模型、细胞培养和2型DN人体肾组织研究，并应用特异SiRNA转染、免疫印迹等技术进一步论证糖尿病肾组织细胞内天然免疫信号--髓分化因子88(MyD88)、NOD样受体P3(NLRP3)的信号活化同肾脏固有细胞（肾小球系膜细胞/小管上皮细胞等）表型转化的生物学行为间联系及其异常与糖尿病性肾小球硬化/肾小管间质纤维化的关系；探讨MyD88、NLRP3及胶原伴侣分子-热休克蛋白47表达异常在2型DN肾纤维化进程中细胞外基质重塑作用及其调控肾脏细胞表型的内在关联，以期阐明DN肾纤维化过程天然免疫应答机制；为创造性地研究2型DN发生机制及防治提供全新理论依据及关键靶点。

免疫损伤是糖尿病肾病(DN) 研究的热门话题，天然免疫信号传导调节是肾脏启动有效、适度的免疫应答的关键环节，发现并揭示其启动和调节机制，对深入理解天然免疫应答、寻求肾脏相关疾病尤其是DN 的干预新策略具有重要意义。首先通过研究高糖环境培养下大鼠肾小管上皮细胞NLRP3炎症小体的表达及其相关炎性因子、纤维化因子的表达；运用NLRP3siRNA的干扰技术及血管紧张素受体拮抗剂（ARB）干预受高糖刺激后的肾小管上皮细胞，论证NLRP3炎症小体在糖尿病肾脏疾病的潜在作用机制以及ARB是否能阻断NLRP3炎症小体的作用；设计不同时间点，验证高糖刺激的时间长度对NLRP3炎症小体及通路相关分子的表达变化。方法：使用慢病毒包装NLRP3siRNA，设计MOI值的浓度梯度，使用阴性病毒感染NRK，荧光显微镜下观察细胞转染阳性率，Q-PCR检测NLRP3mRNA的表达变化，摸索最合适的MOI值用于后续实验。实验分3部分进行：第1部分 细胞分3组：低糖对照组、甘露醇组和高糖组，验证高糖、高渗对NLRP3表达的影响; 第2部分：经慢病毒转染将沉默NLRP3质粒转染至NRK细胞中，实验分为低糖组，低糖+NLRP3 SiRNA组，低糖+空载组，验证NLRP3 SiRNA效率。第3部分：实验分为5组两个时间点：LG组、HG组、HG+sh组、HG+NLRP3-sh组、HG+ARB组，Q-PCR法检测24h、48h的NLRP3、胱冬肽酶-1（caspase-1）、核因子kB mRNA的表达；Western-Blot检测24h、48h的NLRP3、热休克蛋白47、NF-kB P65、Vimentin、Ⅳ型胶原蛋白的蛋白表达；ELISA法检测细胞上清液白介素-1β、肿瘤坏死因子-ɑ的表达水平。重要结果:1.与低糖组比较，高糖组NLRP3 mRNA表达增加(P<0.05),甘露醇组NLRP3 mRNA表达差异无统计学意义 2. 五组细胞干预处理24h，48h后，与低糖组比高糖组NLRP3 mRNA及NF-kB ，Caspase-1mRNA的表达明显增加，NLRP3、HSP47、NF-kB、Vimentin、COlIV蛋白的表达显著上调，细胞上清液IL-1β、TNF-ɑ的表达显著增加；与高糖组比，ARB组的NLRP3、Caspase、NF-kB mRNA 的表达显著下调。