基于蛋白合成速度筛选miRNA靶基因的新技术研究

申请者前期工作中初步建立了基于35S脉冲标记15分钟内新表达的蛋白，从而更迅速更可靠地识别受到miRNA调控的蛋白产物生成的变化，有潜力成为筛选miRNA靶基因新的强有力的手段。前期工作同时也获得两个黑色素瘤相关的候选miRNA（hsa-miR-182、hsa-miR-211）。本课题将通过把选定的miRNA或阴性对照转入黑色素瘤细胞，继而用35S标记的Met／Cys混合物对细胞进行不同长度的脉冲标记，从而筛选出表达水平发生改变的蛋白，并进行鉴定和验证。同时力求在蛋白合成速度动态数据基础上，探索构建新型可视性蛋白调控网络。

本实验室创立的动态蛋白质组学SiLAD技术（35S in vivo Labeling Analysis for Dynamic Proteomics）能特异性地显示标记时间内新合成的蛋白质，从而实现对众多蛋白质“合成速率”变化的高时间分辨率的监测，特别是在研究“触发式”生物学过程中具有明显的优势。文献报道miR-137能够结合多个靶mRNA对肿瘤细胞起到重要的调控作用。为此，本研究采用SiLAD技术筛选miR-137在Ma-Mel-79b黑色素瘤细胞中的靶基因。结果显示，与传统CBB染色相比，SiLAD能够在转染后早期时间点（30分钟）筛选出更多的差异蛋白，并发现大部分差异蛋白在转染后3hr出现合成速率的显著上调。我们随后对转染miR-137后六个不同时间点进行了SiLAD检测，发现miR-137转染早期大部分蛋白合成速率呈现“一过性”上调的变化规律，另一少部分蛋白呈现合成速率“持续性”下调；基于合成速率的指标我们得以进一步对miR-137所调控蛋白合成的变动模式分为六大类型。后续我们通过荧光素酶报告实验证实SiLAD筛选得到的PAK2与GLO1确为miR-137在黑色素瘤细胞中的两个直接靶基因，其中miR-137能够降低PAK2 mRNA的稳定性以及其蛋白表达水平。在进行功能研究是发现miR-137能够促进黑色素瘤细胞凋亡，抑制多种黑色素瘤细胞的体外增殖；使用抑制剂降低内源性miR-137的活性能够增加PAK2的表达，同时促进黑色素瘤细胞的体外增殖能力。进一步研究发现，miR-137通过调控PAK2的活性抑制NF-κB的活性。并发现ERK1/2可参与miR-137调控的生物学过程。miR-137过表达以及沉默PAK2也能够显著抑制ERK1/2通路的活性，在miR-137或U0126抑制剂处理细胞后回补PAK2能够使ERK1/2活性发生明显回调，同时使Ma-Mel-86b细胞的增殖能力发生回复。以上结果表明miR-137能够通过调控PAK2参与ERK1/2信号通路而抑制细胞的体外增殖能力。本论文结果表明SiLAD动态蛋白质组学技术可以为非编码小RNA靶基因的筛选提供一个有价值的新工具。