基于甲型流感血凝素柄部的广谱疫苗研制与初步保护机制研究

Conventional influenza vaccines provide limited protection against mismatching influenza virus strains. Current universal influenza vaccines in clinical trials cannot induce neutralizing antibodies, thereof providing infection-permissive immunity. Therefore, it is urgently needed to develop such a universal influenza vaccine that can elicit robust neutralizing antibody titer and resist to viral infection by multiple subtypes of influenza A strains. Applicant has found that HA stalk and M2e antigen combination in double-layered protein nanoparticle vaccine can induce synergistic cross-neutralizing immune protection, however, the specific neutralizing immunity strength still needs to be improved. Based on these data, applicant proposes to utilize influenza virus-like particle vector and adjuvant fusion protein to develop HA stalk based novel universal influenza vaccine. This project will 1) utilize pseudotype virus system to construct virus-like particle displaying both HA stalk domain retaining native conformation and adjuvant fusion protein; 2) evaluate the vaccine immunogenicity and immune protection efficacy in mouse model; 3) preliminarily elucidate the mechanisms of humoral and cellular cross-reactive immune protection induced by virus-like particle influenza vaccines. It is expected that the novel vaccine can offer efficient and long-lasting immune responses, overcoming the limited immune-protection potency and relatively short protection period by seasonal flu vaccination, providing new countermeasure for the prevention and control of influenza virus.

传统流感疫苗只能针对特定株型提供有限的免疫保护。目前临床试验阶段的广谱流感疫苗诱导中和抗体的效果不佳，不能有效阻止病毒感染。因此，研制能诱导高滴度中和抗体并抵御多亚型甲型流感病毒感染的新型广谱流感疫苗显得尤为迫切。申请人前期研究结果表明双层蛋白质纳米团簇疫苗中HA柄部和M2e双抗原组合能够在小鼠体内有效诱导广谱、中和性、协同免疫保护，但是特异性免疫水平仍有待提高。基于此，申请人拟结合流感病毒样颗粒载体和佐剂融合蛋白，研制基于HA柄部的新型广谱流感疫苗。本项目将1）利用假病毒系统，构建病毒样颗粒展示具有天然构象的HA柄部和佐剂融合蛋白分子；2）在小鼠模型免疫实验中，评测该疫苗的免疫原性和免疫保护效力；3）初步阐明病毒样颗粒流感疫苗诱导的广谱体液免疫和细胞免疫保护机制。期望新型疫苗能提供高效、长期的免疫应答，克服传统流感疫苗保护效力低、保护周期短的缺点，为流感病毒防控提供新的手段。

传统流感疫苗针对HA抗原性匹配的毒株提供有限的免疫保护。研制能诱导高滴度交叉中和抗体并抵御多亚型甲型流感病毒感染的新型广谱流感疫苗显得尤为迫切。近年来大量研究表明HA柄部相较于头部的空间构象和氨基酸序列都更加保守，其特异性抗体反应能够提供广谱中和病毒效果。临床研究表明疫苗诱导的HA柄部特异性抗体反应与交叉免疫保护作用正相关。基于我们对甲型流感病毒颗粒表面拓扑结构的初步理解，设想共展示在病毒样颗粒表面的佐剂蛋白质不仅能通过激活模式识别受体增强特异性免疫反应，还能在颗粒表面间隔共展示的紧密排列的H1柄部分子。空间上间隔H1柄部可能使抗原表位充分暴露于B细胞受体，进而增强H1柄部特异性抗体反应。本课题主要研究内容是构建、表达、纯化嵌合病毒样颗粒共展示H1柄部和Dnak佐剂蛋白。前期免疫实验结果证明大肠杆菌DnaK重组蛋白具有佐剂效果，蛋白质结构分析结论证实Dnak分子的大小和构象适合共展示系统。我们利用昆虫细胞表达系统成功表达并通过蔗糖密度梯度高速离心法纯化嵌合病毒样病毒颗粒，使用全长H1特异性高免血清验证病毒样颗粒展示的H1柄部具有良好抗原性，通过透射电子显微镜观察到嵌合病毒样颗粒形态，其粒径约为100nm，通过BALB/c小鼠免疫实验证实了嵌合病毒样颗粒在体内具有良好的免疫原性并能诱导特异性免疫保护抵抗致死剂量H1N1病毒感染。为了进一步维持H1柄部天然结构，我们合作开发了VirusMED数据库，收集了抗原表位、小分子药物靶点和金属结合位点等病毒蛋白热点信息，并描述空间界面上原子间相互作用。本项目研究工作证明了嵌合病毒样颗粒疫苗载体平台可有效表达和展示H1柄部抗原。本课题组将来改造获得具有天然抗原性的HA柄部蛋白质结构，可利用该纳米颗粒疫苗平台开发免疫原性更强，广谱免疫保护效果更好的广谱流感疫苗。