基于量子点的活细胞多靶点同时监测新方法研究

Single molecule-sensitive probes for imaging RNA in live cells, monitoring cell functions and cell-to-cell communication in the cellular environment has enormous implications for cell biology, disease diagnosis and therapy. QDs are widely used as fluorescent probe in biological imaging and analysis because their luminescence is both strong and stable, and because they can be biofunctionalized. But it is required for QDs applied in in live cells with minimal size and toxicity and infrared emission wavelength. In the past years, we have developed the method to synthesize the QDs CdTe: Zn2+ of minimal size and toxicity and infrared emission wavelength. Combined it with the QDs of one-step DNA-programmed growth, the typical methods of the intracellular RNA imaging and the detecting of secreted platelet-derived growth factor (PDGF) by neighbouring cells with high spatial and temporal resolution will be developed. The probe and imaging strategy will be sensitive enough for the accurate detection of the cellular RNA population, and the tracking of RNA through biogenesis, transport, translation, and degradation pathways. The fluorescent sensor of PDGF based on the QDs attached to the cell membrane can quantitatively detect PDGF that is secreted by neighbouring cells in the cellular environment in-situ, in real time and dynamically. It will be a sensitive and selective method for the single molecule and single cell analysis. With different color and DNA sequence coded QDs, the sensor for multiplexed DNA/RNA and protein detection can be developed. The throughput and potential of detection will improved greatly. It will be a general mothod for single molcule and single cell imaging and detecting. It can be also applied in the monitoring of the other intracellular and intercellular molecules, which make the present method changed significantly.

获取细胞信息及胞间通讯，对于理解细胞生物学、发展有效的疾病诊断及治疗方法意义重大。活细胞研究要求量子点粒径小、近红外、低毒无毒。将较理想的锌掺杂量子点与一步法合成的DNA功能化量子点结合，以胞内RNA 和临近细胞分泌的血小板源生长因子为研究对象，探索量子点探针导入活细胞及胞内RNA与胞间信号分子监测方法，实现超高时间和空间分辨及超高灵敏检测，既可准确测定胞内RNA的分布，又可示踪其产生、传输、转录和降解过程；细胞膜表面偶联基于量子点的荧光传感器可以检测单个临近细胞分泌的血小板源生长因子，具有原位、实时、动态等优点，为单分子及单细胞生命信息获取提供分析新方法。采用不同发射波长量子点和不同序列DNA构建荧光传感器，可实现多个核酸/蛋白的同时监测，提高检测通量和检测能力。此研究将使现有的单分子及单细胞分析检测技术发生根本性变化，并可拓展到其它分子及细胞间相互作用的定量研究和信息获取。

量子点具有一元激发，多元发射特性。本项目将量子点等的优良光学特性应用于活细胞多靶点同时检测研究，建立了监测细胞内单个病毒核酸、衣壳蛋白和基质蛋白去组装及组装过程的新方法，并构建了多种同时高灵敏检测核酸及蛋白的新方法。主要研究成果如下:.1. 研制出了小粒径、近红外、锌离子掺杂的DNA功能化量子点，并将合成方法不断改进，从两步法发展成为一步法，且DNA功能化量子点已成功用于活细胞及活体肿瘤成像分析。.2. 分别标记病毒基因组RNA、衣壳蛋白和基质蛋白，构建了具有良好侵染能力的双色和三色荧光标记病毒颗粒，对单个艾滋病毒入侵宿主细胞时的解离脱壳过程进行实时、动态、可视化分析，该研究为国际上首次实现活细胞内单个艾滋病毒脱壳过程的实时动态解析，对深入理解艾滋病毒在宿主细胞中的生命周期具有重要意义，也将为开发新的抗病毒途径提供思路。.3. 将核酸杂交链式反应的放大作用与蛋白质自组装技术相结合，构建了多种检测癌症相关基因、蛋白和癌细胞的新方法，并对细胞表面超分辨技术进行了系统评述，对不同瞬态结合的超分辨率技术及超分辨模态进行了比较分析。.4. 利用核酸互补杂交、抗原-抗体、生物素-亲和素、适体-靶技术，结合信号放大和量子点荧光检测，构建了多种检测核酸、蛋白及生命活性小分子的新方法，实现了活细胞内外多种生命相关分子的检测；将DNA及蛋白质自组装双放大技术结合，建立了核酸、蛋白及细胞分别检测及多靶点同时检测的新方法。.5. 纳米材料组装及高通量检测方法研究:开展了纳米材料组装研究，并与液滴微流控技术结合，成功实现了DNA、蛋白质以及重金属离子的分析检测，表明该方法具有很强的通用性和实用性。.在ACS AMI，AC，BB，CC，ACS Nano等学术刊物发表学术论文23篇，其中采用DNA及蛋白质自组装双放大技术，所建立的癌细胞高灵敏检测方法，被选作Anal Chim Acta的封面文章。获授权发明专利2项，参编专著《纳米生物检测》1章，对“基于量子点的多色荧光检测技术及其应用”进行了系统介绍。参加国际国内重要学术会议12次（部分会议派研究生参加），作特邀报告7 次，口头报告1次。培养研究生9名（博士生7名），1位博士生的学位论文获2015年湖北省优秀博士论文，项目负责人获湖北省优秀博士论文指导教师称号。