珍稀濒危药用植物铁皮石斛菌根互作的分子作用与表达机制

铁皮石斛为珍稀濒危药用植物，在人工常规栽培条件下，其组培苗繁殖及成活率低、生长缓慢。本课题组研究显示，人工接种菌根真菌能较好地在铁皮石斛根中形成典型的兰科菌根，并能显著地促进铁皮石斛生长发育。为深入了解其共生促生的分子作用和表达机制，本课题前期已成功构建了铁皮石斛与菌根真菌共生互作的菌根差减cDNA文库。在此基础上，本项目拟对该文库进行筛选，从中找出与铁皮石斛生长发育相关的差异表达基因；再通过Real-time RT-PCR和RNA原位杂交技术，分析目标基因的时空表达特征；最后对差异表达明显的目标基因克隆其全长cDNA，并进行分子表达鉴定，了解其分子作用与表达机制。上述研究结果将为铁皮石斛菌根互作理论提供分子基础资料，为菌根真菌促进兰科植物生长及其资源的可持续利用提供科学依据。

研究证实铁皮石斛生长受菌根真菌影响，菌根真菌可显著地影响铁皮石斛的生长和发育，但究其分子作用和表达机制不详。本研究首先通过构建菌根互作条件下的铁皮石斛根的差减cDNA文库，检测其差异表达基因；再从菌根互作的铁皮石斛中克隆出受菌根真菌影响的差异表达基因片段，通过RACE技术克隆出全长序列；并通过qPCR方法检测其在不同时期和不同器官中，这些基因受菌根真菌影响的表达信号变化情况；同时，也直接从铁皮石斛组培苗中克隆出两条对其生长发育有显著影响的基因，并考察了它们在铁皮石斛不同器官中表达量的变化特点。主要结果如下：. 构建了菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cDNA 文库，从中获得了1 975 个阳性克隆。经检测，90%以上克隆能扩增出有效产物，通过检测，大部分为植物应对环境胁迫防御性基因。. 从铁皮石斛菌根共生材料中克隆出两条对其生长发育表达影响显著的基因。一条为促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK1) 基因，另一条为钙依赖蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinases, CDPKs)基因。DoMPK1 和DoCPK1都为组成型表达基因。但DoMPK1转录本在石斛根、茎、叶和种子等4 种组织中的相对表达量差异不显著，而DoCPK1转录本在各器官中相对表达量依次为根 > 茎 > 种子 > 叶。DoMPK1基因 和DoCPK1基因在小菇真菌侵染的30 天根中, 都显示为显著上调, 表达量分别为其各自对照根中的7.91 倍和5.16倍；这些都表明，DoMPK1基因和DoCPK1基因都可能在小菇真菌−铁皮石斛菌根共生早期互作过程中起作用。. 同时，从铁皮石斛组培苗中克隆到1 个CDKA1基因和1个ZIP基因。CDKA1基因在铁皮石斛原球茎阶段表达量最为丰富，可达4.76倍；其次为根、4.19倍；种子、2.57倍；茎、1.57倍。DoZIP1基因转录本在根中表达量相对较高，为茎中的4.19倍；叶次之，为茎的1.12倍。CDKA1基因和DoZIP1基因的分子特征为下一步研究其在铁皮石斛生长发育过程的生物学功能奠定基础。