促进药用植物铁皮石斛种子萌发的真菌活性物质研究

Dendrobium officinale Kimura et Migo is a rare and endangered valuable medicinal plant in China. Based on former studies on isolating and screening the endophytic fungi which can promote the seeds germination of D. officinale, and establishment and application of the seeds and fungal co-culture system.In this project, the effective fungi Bsg14 (Tulasnella sp.) is picked up to promote the seeds germination of D. officinale, and the active substances in that process are studied, including different extract fractions and chemical composition of fungal culture substances, and then, the activities of these fractions, large molecule and small molecule compounds on promoting the seeds germination of D. officinale are studied , respectively. After systematically research, the main material types can be identified, which embryo cells of D. officinale digest invading fungal hyphae as germination nutrition, and the mechanism that fungi promote the seeds germination of D. officinale can be clarified in terms of material basis, and with an establishment of the theoretical foundation for the application of the promoting germination fungi in large-scale cultivation of D. officinale seeds, at the same time, it can provide the theoretical proofs for the application of fungi in the seed propagation of other endangered orchidaceae medicinal plants, and set an example for the study of fungi in the seed propagation of other endangered medicinal plants.

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是我国珍稀濒危的名贵药用植物。在我们前期对促进铁皮石斛种子萌发真菌分离、促进种子萌发真菌筛选、种子与真菌共培养体系建立和应用研究的基础上，本项目选择促进铁皮石斛种子萌发优良的真菌Bsg14（Tulasnella sp.）,对其促进铁皮石斛种子萌发作用的活性物质进行研究，主要包括这一真菌培养物的不同提取部位和化学成分研究、这些不同部位和所得的大分子和小分子化合物分别对铁皮石斛种子萌发作用的活性研究。通过系统的研究，明确真菌促进铁皮石斛种子萌发的主要物质类型，从物质基础的角度阐明真菌促进铁皮石斛种子萌发机制；为促萌发真菌在铁皮石斛种子大规模栽培中的应用奠定理论基础；同时对推动真菌在其它濒危兰科药用植物种子繁殖中的应用提供理论依据，并起到示范作用。

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），为兰科石斛属附生草本植物，是我国传统的名贵中草药。其种子无胚乳，自然条件下需要与真菌共生才能够正常萌发与生长。为了揭示促萌发真菌胶膜菌属（Tulasnella sp.）Bsg14的活性物质背景，本研究从化学、生理生化等方面对真菌Bsg14进行了系统研究。.首先明确了发酵液与菌丝体提取物的促种子萌发活性。提取物的水部位具有显著的促萌发活性，其次为乙酸乙酯部位。采用UPLC-QTOF-MS/MS技术对水部位成分进行分析，在菌丝体和发酵液水部位中分别鉴定到了375种和392种代谢物，包括生物碱类，氨基酸，糖类等物质，参与种子萌发过程中的光合作用以及信号传导等事件。在发酵液乙酸乙酯部位中分离鉴定到苯甲醇（1），香草酸（2），丁香酸（3），异香兰酸（4），吲哚-3-甲酸（5），吲哚-3-甲醛（6），3,5-二羟基苯甲酸（7），3,4-二羟基苯甲酸（8），反式-阿魏酸（9），邻苯二甲酸二丁酯（10），邻苯二甲酸二异丁酯（11）和2,6,6-trimethyl-4-oxo-2-cyclohexene-1-acetic acid（12）。活性考察发现，化合物1,5,8可以在一定浓度时显著促进种子萌发与发育。.菌丝体与发酵液多糖均具有显著的促种子萌发与发育的活性，其中菌丝体多糖可以将4级萌发率提高至20%以上。PMP衍生化法分析发现，菌丝体多糖主要由葡萄糖、甘露糖与岩藻糖等8种单糖组成，与发酵液和WBA培养基多糖组成不同。经过水解后仅菌丝体多糖可以保留其活性，表明其水解后的组成中含有活性成分。对组成菌丝体多糖的8种主要单糖活性进行分析，发现8种单糖混合物可以促进种子的早期萌发与原球茎发育，但浓度过高则会严重抑制，可能与膜渗透性有关；低、中浓度菌丝体多糖特有的岩藻糖可以使萌发率在20天时提高50%以上，并促进幼苗发育与生根。.采用HPLC-MS/MS方法对发酵产物中的植物激素进行分析，发现油菜素内酯和赤霉素为真菌代谢产生，吲哚乙酸的含量在菌丝体中最高。活性考察发现，赤霉素可以显著促进原球茎的后期伸长发育。该项目研究揭示了内生真菌促进兰科植物铁皮石斛种子萌发的的物质背景，为真菌在其它濒危药用植物种子繁殖中的应用研究起到示范作用。