菊花及其近缘种属植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因克隆与功能鉴定

菊花是中国十大传统名花和世界四大切花之一，园林应用范围极广，有很高的观赏和经济价值。本申请项目拟从菊花及其近缘种属对盐不同敏感类型的种质中，同源克隆编码细胞质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因，通过酵母和拟南芥相应突变体互补实验初步验证其功能，并采用Real-time PCR和原位杂交技术分析其组织表达特性；采用TAIL-PCR方法克隆不同种质来源SOS1s相应的启动子，分析调控元件；利用超表达和RNAi技术获得转基因的菊花及其近缘种属材料，开展抗盐性鉴定，并运用SEM-EDX技术和CoroNa-GreenAM 染料对植株体内Na+的分布与运输进行检测，以分析正常生长条件下不同种质来源SOS1s序列特征与Na+转运效率及耐盐性的相关性。本申请项目的实施可揭示菊花及其近缘种属SOS1s对Na+的转运机制及其调控表达特性，同时获得Na+的高效转运基因，为菊花抗盐分子育种奠定基础。

菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，用途和栽培地域极广，观赏和经济价值很高，在花卉生产中占有十分重要的地位。盐胁迫严重影响植物的生长和发育，在切花菊设施栽培中土壤次生盐渍化及我国大面积盐渍土是制约菊花生产与园林应用的主要因子。此外，菊花是浅根观赏花卉，忌水湿，夏季田间积涝会导致其大面积死亡；涝与盐协同胁迫对菊花生长产生的伤害更大，因此有必要对两者协同胁迫的机制进行研究。为此，本研究经鉴定发现盐胁迫下，芙蓉菊和牡蒿耐盐性极强，大岛野路菊耐盐性强，菊花‘神马’对盐胁迫敏感；分别从菊花及该3种近缘种属植物中克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因，各自命名为AjSOS1、CrcSOS1、CcSOS1和CmSOS1。实时定量PCR分析发现盐处理均诱导4个SOS1s基因表达上调，AjSOS1和CrcSOS1表达水平较高；4个SOS1s均能回补酵母突变体ANT3对Na+的转运功能，在含盐培养基上酵母细胞表达AjSOS1长势最好，CrcSOS1次之，CcSOS1长势弱于CrcSOS1，强于CmSOS1，而CmSOS1长势最差；进一步构建遗传转化表达载体pMDC32-SOS1s，分别采用农杆菌介导的叶盘法和拟南芥花粉管侵染法将4种载体转入盐敏感的‘神马’、拟南芥野生型gl1和突变体sos1-1，对转基因株系盐处理发现，从耐盐植物中分离的SOS1s比盐敏感植物中的SOS1s有较强的耐盐性。另外，通过定点突变产生一系列AjSOS1muts并回补酵母突变体ANT3，发现AjSOS1序列中影响其耐盐活性的关键氨基酸位点；超表达CmSOS1提高了转基因菊花株系的耐盐和耐涝性，反义和干扰CmSOS1均降低了转基因株系的耐盐和耐涝性。该项目对耐盐性差异显著的菊花及其近缘种属植物进行的耐盐机理研究及耐盐优异基因SOS1的挖掘，为加快培育耐盐菊花新品种奠定了基础。该项目培养研究生4名，发表SCI论文8篇。获得江苏省科学技术奖一等奖1项。