菊花MYB2转录因子调控花期的分子机理研究

Chrysanthemum is an important ornamental plant across the world. It is a typical short-day (SD) plant that responds to shortening day length during the transition from the vegetative to the reproductive phase, which challenges the sustainable chrysanthemum producing due to high energy cost. CmMYB2 changed flowering of its overexpressed Arabidopsis, while induced flowering of its overexpressed chrydanthemum, but the mechanism involved in regualting flowering time remained unclear. In present proposal, we aim to uncover the molecular mechanism of CmMYB2 in regulating the flowering time of chrysanthemum and Arabidopsis by identifing the downstream genes via gene expression analysis, using yeast two-hybrid to screen CmMYB9A’s interaction proteins in chrysanthemum based on its interaction with CmMYB2 in vivo, CmMYB2’s interaction proteins in Arabidopsis, then using bimolecular fluorescence complementation (BiFC), and GST Pull-down and Co-Immunoprecipitation（CoIP）to confirm the interaction in vitro and in vivo. We will investigate the function of screened interaction protein using over-expression transgenic system in both Arabidopsis and chrysanthemum. Taken together, the present proposal will disclose the mechanism of CmMYB2 complex in regulating the flowering time of chrysanthemum, enrich the understanding of how MYB play roles in flowering time regulation, which will provide the candidate genes for improvement of chrysanthemum flowering time. Therefore, the present proposal is of both theoretical and practical significance.

菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一。多数菊花品种属典型的短日照植物。目前主要通过光温调控以实现周年生产供应，能耗成本高昂。我们前期研究发现超表达CmMYB2转基因拟南芥花期改变，超表达CmMYB2转基因菊花开花提前，但其调控花期的具体机制尚不清楚；通过酵母双杂交发现CmMYB2与CmMYB9A互作。本研究拟通过CmMYB2转基因株系表达谱分析鉴定其调控的下游基因；通过酵母双杂交进一步从菊花文库中筛选CmMYB9A的互作蛋白，从拟南芥文库中筛选CmMYB2互作蛋白，并运用双分子荧光互补技术（BiFC）、GST Pull-down技术和免疫共沉淀技术（CoIP）进行验证，再通过转基因手段对筛选出的目的蛋白基因进行功能鉴定。最终阐释菊花CmMYB2蛋白复合体调控花期的分子机制。该研究不仅能丰富植物MYB转录因子调控花期的理论基础，也可为菊花花期改良提供基因资源，具有重要科学意义和应用前景。

菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有很高的观赏价值和应用价值。我们前期研究发现超表达CmMYB2转基因拟南芥花期改变，但其调控花期的具体机制尚不清楚。本研究以切花菊‘神马’为研究材料，通过进一步研究CmMYB2的功能及调控开花的分子机制，阐释菊花CmMYB2蛋白复合体调控花期的分子网络。将CmMYB2转化菊花‘神马’，发现其超表达株系开花提前，而RNAi干扰株系开花推迟。分别对野生型、超表达株系和RNAi干扰株系进行转录组分析，发现光周期开花途径中的转录因子在不同株系中差异表达。对一些光周期途径的基因进行验证，其中成花激活子（CmFTL3、CmAFL1、CmAFL2、CmM111、CmCOL1）在CmMYB2超表达株系中，其表达量均上调，而在RNAi干扰株系中的相应表达量均下调。为探索菊花CmMYB2参与花期调控的分子网络机制，在酵母中CmMYB2可与锌指转录因子家族蛋白CmBBX24发生相互作用，进而又发现CmBBX24可与锌指转录因子家族的另一个蛋白CONSTANS（CmCOL1）发生相互作用。分别在洋葱表皮细胞和烟草叶片中进行双分子荧光互补（BiFC）实验，进一步验证CmMYB2与CmBBX24，CmBBX24与CmCOL1间的互作，并发现CmMYB2可与其本身形成同源二聚体。为了进一步明确CmCOL1基因的功能，构建了植物正义表达载体pMDC43-CmCOL1，利用农杆菌介导法转化野生型拟南芥和拟南芥co突变体，结果表明，超表达CmCOL1基因的拟南芥植株比野生型开花提前。并且CmCOL1也可部分互补拟南芥co突变体的晚花表型。此外，克隆1.8 kb CmFTL3的启动子片段。烟草瞬时表达研究发现CmCOL1可以结合CmFTL3的启动子区域，进而激活CmFTL3的表达。但CmBBX24转基因菊花却没有引起开花时间的变化，这与已有的报道不同，这可能与研究的菊花品种不同有关。我们验证了CmBBX24干扰转基因株系对干旱敏感，并且发现CmBBX24抑制CmBBX22的表达，同时CmBBX24和CmBBX22存在互作。通过转录组测序和乙烯含量测定发现，CmBBX24干扰转基因和过表达CmBBX22转基因‘神马’通过增加乙烯合成响应干旱胁迫。该研究丰富了植物MYB转录因子调控花期的理论基础；发表SCI论文7篇；培养研究生4名。