积雪草苷和A2aR对肺纤维化中内皮-间质转化的作用及两者关系的研究

Pulmonary fibrosis is a common complication of connective tissue disease which influences the prognosis of these diseases. However, therapeutic choice is limited and unsatisfying to date. The role of endothelial-interstitial transformation in the development and progression of connective tissue diseases associated pulmonary fibrosis is increasingly emphasized. TGF-β/Smads signaling pathway is an important mechanism of endothelial-interstitial transformation. Our previous research has found that asiaticoside and A2aR can inhibit pulmonary fibrosis and the expression of TGF-β1, but the specific mechanism is unclear. Therefore, we speculate that asiaticoside and A2aR may inhibit endothelial-interstitial transformation through the regulation of TGF-β1/BMP-7 balance and TGF-β/Smads signaling pathway, thus alleviating pulmonary fibrosis. In this study, we used classic pulmonary fibrosis mouse model and cell model to investigate the effects of A2aR on TGF-β/Smads, endothelial-interstitial transformation and pulmonary interstitial fibrosis from the angles of overall, cell and molecular levels. At the same time, we set up corresponding asiaticoside treated groups to make horizontal and vertical comparisons between different groups to further explore the its anti-fibrosis mechanism and its interaction with A2aR. We hope from this study, we can provide research basis for a multi-site, multi-channel comprehensive treatment for pulmonary fibrosis, and for optimal agent with little side effect for patients with pulmonary fibrosis.

肺纤维化是结缔组织病常见的、决定预后的并发症，目前治疗方法有限且疗效欠佳。内皮-间质转化在结缔组织病相关肺纤维化的发病和进展中的作用日益被重视。TGF-β/Smads信号通路是其重要的发生机制。我们前期研究已经发现积雪草苷和A2aR具有抗肺纤维化、抑制TGF-ß1表达的作用，但具体机制不明。我们推测积雪草苷和A2aR可能通过调控TGF-β/Smads通路，影响TGF-ß1/BMP-7平衡，抑制内皮-间质转化而阻止肺纤维化。本研究采用肺纤维化动物模型和细胞模型，通过对A2aR基因的特异性敲除（或抑制）及特异性激活，拟在整体、细胞与分子水平研究A2aR在TGF-β/Smads，内皮-间质转化和肺纤维化中的作用。同时设立积雪草苷对照组，通过横向和纵向比较，进一步探讨积雪草苷的抗纤维化机制及其与A2aR的关系。以期为多位点、多途径综合治疗肺纤维化提供研究依据，寻找一种疗效好而副作用小的治疗药物。

肺间质纤维化目前治疗方法有限且疗效欠佳，而内皮-间质转化在肺纤维化的发病中的作用日益被重视。TGF-β/Smads信号通路是其重要的发生机制。积雪草苷(AS)具有促进瘢痕愈合、减少瘢痕形成的作用。然而，它在肺纤维化中的可能作用仍不清楚。腺苷A2A受体(A2AR)是肺纤维化的保护因子，但A2AR对TGF-β/Smads通路的影响尚未见报道。本项目中，我们体外实验证实了积雪草苷具有抑制人肺微血管内皮细胞TGFβ1表达及内皮-间质转化的作用。同时，我们利用A2AR-/-基因敲除小鼠和野生型(WT)小鼠经气管内注射博莱霉素（BLM），制成肺纤维化模型。AS (50mg /kg/d)每日灌胃，连续28 d。通过组织病理学、免疫组化、蛋白印迹等研究方法，结果发现AS能显著改善肺组织的胶原沉积，缓解肺间质炎症。此外，AS具有促进A2AR表达和BMP7通路的作用。因此，我们推测AS可能通过A2AR上调BMP7信号，影响TGF-β1/BMP-7平衡，调控TGF-β/Smads通路来减轻肺纤维化。另外，我们发现A2AR−/−小鼠的肺部炎症和纤维化的严重程度远远高于WT小鼠，通过组织病理学分析发现AS对A2AR−/−小鼠的疗效劣于WT小鼠。通过RNA测序分析，我们发现与对照组相比，博来霉素模型组上调的差异表达基因(DEGs)在免疫和炎症相关通路中富集。BLM相对于正常对照组下调和BLM + AS相对于BLM组上调的差异显著基因共有242个重叠，富集于cAMP和Rap1信号通路。此外，在A2AR的存在下，AS对腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, ADCY1, ADCY5, ADCY8, cAMP和Rap1)这两种通路的5个关键因子的表达具有上调作用。因此，AS可能通过激活A2AR辅助的cAMP和Rap1信号通路来减弱BLM诱导的肺纤维化，进一步支持AS有希望成为PF的治疗选择。