Smad3对PVOD肺静脉内皮-间质转化的调节作用及机制研究

Pulmonary veno-occlusive disease (PVOD) is an uncommon form of pulmonary arterial hypertension characterized by the obstruction of small pulmonary veins and a dismal prognosis. It is frequently misclassified as idiopathic pulmonary arterial hypertension (PAH). PVOD may be sporadic or heritable because of biallelic mutation of the EIF2AK4 and BMPR2 gene. As we know, the abnormal endothelial mesenchymal transition (EMT) in pulmonary hypertension (PH) patients had been proved to be closely related with the genic mutation of BMPR2, which could enhance the expression of TGFβ1, and ultimately lead to mesenchymal transition of pulmonary vascular endothelial cells. Additionally, we had found that α-SMA, a mesenchymal cell marker, expressed in the pulmonary vein endothelial of mitomycin (MMC)-induced PVOD rat model, and the expression of TGF-β and p-smad3 protein increased in the MMC-induced pulmonary vein endothelial cells. Based on this, we suppose that EMT happened in the pulmonary vein endothelia cells of PVOD patients, and MMC could activate TGFβ/BMP signaling pathways. We anticipate further understanding the mechanism of PVOD, and help developing new therapeutic approaches for the treatment of this devastating disease.

肺静脉闭塞病（PVOD）是一种以肺小静脉弥漫性阻塞为病理特征的静脉性肺动脉高压，病因目前仍不明确，该病极易误诊为特发性肺动脉高压。研究发现EIF2AK4或BMPR2基因发生突变能引起PVOD，可是机理不明确。根据肺动脉高压患者异常的内皮细胞间质转化与BMPR2基因突变相关，即BMPR2基因突变可导致TGFβ表达增加，最终诱发肺血管内皮细胞发生间质转化；前期我们研究发现丝裂霉素(MMC)诱导的PVOD模型大鼠增厚的肺微血管内膜层有大量胶原沉积，内膜层表达间质细胞标记物a-Sma；发现MMC处理体外培养肺静脉内皮细胞TGF-β1以及p-Smad3蛋白表达上升。我们提出PVOD患者肺静脉内皮细胞发生内皮间质转化；MMC通过激活TGFβ/Smad信号通路分子的表达和活性，导致肺静脉内皮细胞发生间质转化的假设。希望藉此研究进一步了解该病发病机制，并对该病的预防、治疗和药物开发提供理论依据。

本项目运用临床PVOD患者和丝裂霉素诱导的PVOD模型大鼠肺组织病理切片进行内皮细胞标记物CD31和间质标记物a-SMA标记物进行免疫荧光染色，观察间质标记物在肺血管内皮细胞中的表达情况；体外培养大鼠肺微血管内皮细胞及建立PVOD模型大鼠检测丝裂霉素对微血管内皮细胞及肺组织中内皮标记物、间质标记物蛋白以及TGFβ/Smad3通路相关蛋白表达的影响。通过运用Smad3磷酸化特异性抑制剂SIS3和Smad3特异性小分子干扰RNA抑制TGFβ/Smad3通路的激活，验证此通路在MMC刺激下的微血管内皮细胞发生间质转化中的重要作用。同时，我们用SIS3治疗MMC模型大鼠，通过检测PVOD疾病指标评估SIS3对MMC诱导的PVOD模型的治疗效果，检测治疗组和PVOD模型组肺组织内皮标记物和间质标记物蛋白表达情况，验证SIS3对疾病的靶向治疗作用。我们发现PVOD病人和MMC诱导的PVOD模型大鼠的肺血管内皮细胞大量表达间质标记物α-SMA，而内皮标记物CD31表达量降低。MMC诱导的大鼠微血管内皮细胞间质标记物FN1、Vimentin表达升高，而内皮标记物CD31、VE-cadherin表达降低，且TGFβ/Smad3通路相关蛋白表达升高。Smad3磷酸化抑制剂SIS3可以抑制MMC诱导的大鼠PMVECs间质标记物表达升高，而促进内皮标记物表达。SIS3可以延缓MMC诱导的PVOD模型大鼠疾病的进程，减少大鼠的死亡率；改善大鼠的右心室功能、右心肥厚指数、血管重塑和肺血管周围胶原沉淀情况；降低大鼠体内炎症水平、血管周围炎症浸润和肺水肿程度。SIS3可以降低MMC诱导的PVOD大鼠肺组织间质标记物的表达，升高内皮标记物的表达，抑制PVOD模型大鼠肺微血管内皮EndoMT的进程。在PVOD的发生发展中，内皮会发生间质转化，导致血管内皮细胞失去原有功能，过度增殖，引起血管增厚，最终导致微血管闭塞。进一步研究发现是通过激活TGFβ/Smad3通路引起的内皮细胞发生间充质转化（Endothelial-mesenchymal transition，EndoMT），从而导致内皮细胞过度增殖，肺微血管肌化甚至闭塞。而Smad3磷酸化抑制剂SIS3可以抑制TGFβ/Smad3通路的激活，从而抑制EndoMT的发生，延缓PVOD的发生发展。