肺上皮-间质细胞转化在急性肺损伤肺纤维化中的作用及氢对其调控机制的研究

Pulmonary fibrosis induced by acute lung injury is the most important cause of death in acute respiratory distress syndrome. Recent studies have showed that, Lung epithelial cells can transform into myofibroblasts through epithelial-mesenchymal transition（EMT）and the increase in muscle fiber cells and collagen deposition in lung tissue is one of the most important factors leading to pulmonary fibrosis.Because of lack of effective and safe treatment for pulmonary fibrosis so far, It has important clinical significance to seek new and effective anti-fibrosis drugs.As the pre-test confirmed that reduce of Hydrogen production in body may be one of the factors of lung injury progression, the purpose of this study is to assess the antifibrotic efficacy and safety of hydrogen. It provide a theoretical basis and a new target for the treatment of acute lung injury in pulmonary fibrosis through exploring signal transduction networks and molecular mechanisms of lung epithelial - mesenchymal transition.

急性肺损伤导致肺纤维化是急性呼吸窘迫综合症最重要的致死原因。近期研究表明，肺上皮细胞可发生上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT)转变为肌纤维细胞，从而导致的肺组织中肌纤维细胞增多是肺组织异常纤维化及胶原沉积最重要的因素之一。对于肺纤维化迄今缺少有效安全的治疗手段，因此，积极寻求新的有效的抗纤维化药物有着重要的临床意义。由于前期试验证实机体产氢减少这一自身保护机制的削弱可能是肺损伤病情进展的因素之一，故本课题通过研究氢对肺上皮细胞的上皮-间质相互转化的作用及补充氢对急性肺损伤纤维化大鼠的治疗作用，评估氢抗纤维化的有效性及安全性。本课题进一步研究肺上皮细胞的上皮-间质细胞转化的信号传导网络及分子机制，为急性肺损伤肺纤维化的治疗提供提供理论基础及新的靶点。

研究背景：机械通气（Mechacical ventilation，MV）引起肺部的纤维化病变是呼吸机通气患者后期难以拔管的主要原因之一，探讨其发生机制对有效预防机械性通气损伤具有重要的意义。研究内容：本项目研究了肺上皮-间质细胞转化在急性肺损伤肺纤维化发生发展中的作用及氢对其是否具有治疗和调控效果。研究方法：动物实验选择ICR小鼠，小鼠全身麻醉后行气管插管并连接小动物呼吸机进行不同潮气量的机械通气，通气结束后收取肺组织标本；肺组织切片HE染色反映肺组织水肿，出血及肺组织病理学改变，Masson染色反映肺组织纤维化病变，免疫荧光双标记染色进行肺血管内皮细胞、间质细胞的定位，定性及半定量分析；肺组织抽提RNA或蛋白质检测肺组织内皮细胞标记物及间质细胞标记物表达的变化；肺组织中纤维化及炎症标记蛋白含量的变化用ELISA方法检测；细胞实验选择原代培养小鼠肺血管内皮细胞（MLVECs）对在体实验进行验证，对MLVECs行机械牵拉牵拉后24h收取细胞上清，用ELISA方法检测纤维化及炎性标记蛋白含量的变化；抽提细胞蛋白检测内皮细胞及间质细胞标记物表达的变化；免疫荧光双标染色显示内皮细胞及间质细胞标记物的定位表达含量的变化；并给予氢气/激素观察上述相应指标的变化。重要结果：接受机械通气的小鼠肺组织内有大量胶原沉积，且羟脯氨酸和I型胶原的含量以及TGF-β的分泌在通气后3到14天呈持续性高表达；机械通气引起肺纤维化的同时，伴随着间质细胞标记物（α-SMA）和波状蛋白（vimentin）表达的增多以及上皮细胞标记物（E-cadherin）和内皮细胞标记物（VE-cadherin和CD31）表达的降低；免疫荧光双标显示在某些肺血管内皮细胞上有α-SMA和CD31的共染区域，提示机械牵拉可诱导EndMT的发生，这一现象也在细胞实验中得到证实；给予氢气/激素后肺组织/细胞纤维化程度有所减轻，但仍有不同程度的纤维化。科学意义：本研究通过运用分子生物学技术，在模型动物及细胞层面证实了肺组织机械性损伤后内皮细胞向间质细胞转化参与了机械通气引起的肺纤维化，这一现象在损伤早期可以被氢气/激素所部分逆转，本课题的完成对临床预防呼吸机相关性肺损伤具有重要的临床指导作用。