hVECs联合培养体系中Bmi-1、Runx2基因变化与hBMSCs的增殖和成骨分化的研究

该研究是本课题组先前骨组织工程种子细胞研究的深入，研究表明人血管内皮细胞（hVECs）能促进联合培养体系中人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的增殖和成骨分化。本研究采用RNAi技术原理静默hVECs的骨形成蛋白-2(BMP-2)基因，分别采用正常hVECs和BMP-2基因静默的hVECs和hBMSCs构建联合培养体系，利用RT-PCR技术定量分析培养体系中各组hVECs对hBMSCs的Bmi-1和Runx2基因的影响；进一步研究hVECs对hBMSCs的促进增殖和成骨诱导机理；探讨hVECs的BMP-2因子对hBMSCs的Bmi-1和Runx2基因的影响，明确hVECs调控hBMSCs的Bmi-1和Runx2基因表达的主要因素。为hVECs和hBMSCs联合培养系统在骨组织工程种子细胞研究中提供实验数据、理论依据和新方法，解决组织工程种子细胞在支架材料上增殖、黏附和成骨分化的难题。

研究方法 1、分离纯化及鉴定hBMSCs；hUVECs进行体外培养鉴定， Western Blotting法检测其BMP-2蛋白的表达；2、用质粒作为载体包装设计的shRNA，将构建的干扰基因序列转染到细胞中，并采用Western blotting法鉴定对hUVECs的BMP-2的RNA静默的效果；3、按1:1比例建立联合培养组、联合培养干扰组，单独hBMSCs组、单独hUVECs组为阴性对照，计数各组hBMSCs数量；4、检测各组碱性磷酸酶及骨钙素含量。Western Blotting检测各组中hUVECs的BMP-2蛋白表达；5、荧光定量PCR法检测各组中Bmi-1和Runx2基因表达。6、SPSS17.0 软件对各项检测值进行统计学分析。. 主要结果 1、密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化的hBMSCs纯度较高；2、Western Blotting检测显示hUVECs正常表达BMP-2蛋白；3、2号质粒转染后细胞BMP-2蛋白表达明显降低，最佳转染条件：质粒3ug、脂质体10ul，转染6小时，转染效率约为60%；4、各时间点联合培养组细胞数最多，组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；5、联合培养组BMP-2的表达增高，联合培养干扰组BMP-2的表达显著降低；各时间点联合培养组ALP、OC最高，组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；6、各时间点联合培养组和联合培养干扰组Bmi-1基因表达较高，联合培养组和联合培养干扰组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；单独hBMSCs组与联合培养组和联合培养干扰组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)；7、各时间点联合培养组Runx2基因表达量最高，组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。. 结论 1、hUVECs能正常表达BMP-2蛋白；2、构建质粒达到BMP-2的RNA干扰要求；3、hUVECs可促进hBMSCs增殖及成骨分化，提高联合培养体系中hBMSCs的Bmi-1表达，但此信号通路上游调控并不是BMP-2；4、Runx2表达增加是hBMSCs在联合培养体系中成骨分化加速的关键因素之一；5、联合培养体系中存在BMP-2/ Runx2通路，但BMP-2不是联合培养体系中Runx2通路上游唯一的影响因子。