人羊膜上皮细胞诱导分化组织工程结膜重建

结膜对维持眼表的完整和泪膜的稳定至关重要。对于酸碱化学伤等难治性眼表疾病，临床上常缺乏正常的结膜组织进行眼表重建。研究表明人羊膜上皮细胞（HAEC）具有类似胚胎干细胞的分化潜能；我们前期工作已证实，HAEC在诱导条件下可以向角膜上皮细胞转分化。据此推测，HAEC 可能作为"种子细胞"用于组织工程结膜构建。本项目拟采用HAEC 作为种子细胞，体外培养、扩增，绿色荧光蛋白（GFP）基因转染示踪；共培养诱导HAEC 向结膜上皮细胞转分化；纤维蛋白胶载体上构建复层结膜上皮植片；并进行组织工程结膜移植动物实验，观察植片的存活情况及其组织相容性。本研究试图建立诱导HAEC 转分化为结膜上皮细胞的方法和技术程序，为HAEC 构建组织工程结膜的可行性提供实验依据，并由此为解决眼表重建结膜材料的短缺等难题提供新方法和思路。

目的：建立体外培养人羊膜上皮细胞（HAECs）和兔结膜上皮细胞的方法，通过将两种细胞共培养，观察并检测是否能将人羊膜上皮细胞诱导分化为结膜上皮样细胞.方法：①分别采用酶消化法和组织块法获得HAECs和兔结膜上皮细胞，并对培养的细胞进行形态学观察；②将HAECs和兔结膜上皮细胞在Transwell非接触共培养系统中共培养10天，以诱导HAECs分化；③通过倒置显微镜和原子力显微镜对诱导前后的HAECs进行形态学及超微结构比较，对诱导前后的HAECs进行PAS染色、HE染色，免疫荧光法检测诱导前后HAECs中CK4、MUC4、MUC5AC的表达，实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测分化细胞MUC4、MUC5AC mRNA的表达。④在制作好的CS-COS-HA膜上培养hAECs，在培养2d，4d，6d各取4孔测计算相对增值率（RGR），进行毒性评价，观察CS-COS-HA共混膜上的hAECs的克隆形成率。.结果：共培养后的人羊膜上皮细胞和兔结膜上皮细胞形态较为相似，诱导后的HAECs中可见少量PAS阳性细胞，细胞免疫荧光法检测到诱导后HAECs中CK4、MUC4、MUC5AC呈阳性表达，qRT-PCR检测到分化后细胞MUC4、MUC5AC mRNA表达水平较诱导前上调。CS-COS-HA共混膜组RGR值在2、4、6d时分别是94.70、87.55、93.47，有轻微细胞毒性。CS-COS-HA共混膜上的hAECs可在其贴壁、增殖，细胞生长状态良好。.结论：HAECs在与兔结膜上皮细胞共培养诱导条件下，可以向结膜上皮样细胞和杯状细胞转分化。CS-COS-HA共混膜材料具有良好的生物相容性，轻微的细胞毒性，材料评价合格，可以用于细胞培养及组织工程载体构建。