表达双价抗菌肽基因的重组酵母对几种新疆特色水果采后病害的防治及防治机理研究

Using genetic manipulation to improving antagonists is a new field in biological control of postharvest fruit. Cationic antibacterial peptides were used wildly in medical and animal feed field due to its broad spectrum, effective antimicrobial activity and non-toxic to hosts. We found in oue early rsearch work that the recombinant strains expressing cecropin A and psd peptide respectively can improve the antifungal effect of Pichia pastoris on postharvest fruits disesaes. In consideration of the different cell membrane disruption mechanism of cecropin and psd, so we speculate that simultaneous expression of two peptides may synergistically inhibit the growth of fungus. We plan to construct the binary yeast expression vector pPIC-cec-psd through analysing by molecular biology software and optimizing original gene sequence, transfer recombinant vector into GS115, select and express the high transformation son of resisting etc by gradient G418, purify heterologous protein and assay its MIC to some main fungus, assay the biocontrol effect of the recombinant strain to some kinds of Xingiang feature fruits in vitro and in vivo, at last, study the antifungal mechanism of the recombinant strain from cell and molecular level, these research will establish the theoretical basis for further large scale application of the recombinant strain.

通过分子生物学技术对现有拮抗酵母进行改造以提高其生防效力是生物防治研究中的新领域，阳离子抗菌肽以其高效广谱的抗菌性和安全无毒性得以广泛应用于医学、动物饲料等领域，前期研究发现将杀菌肽Cecropin A及豌豆防御素Psd分别表达于生防拮抗菌毕赤酵母中能明显提高空酵母菌株对水果采后病害的生防效果，而两者的空间结构及作用机制有所不同，故推测两者在真核中的同时表达，有可能对病源真菌有协同抑制作用，本项目拟通过分子生物学软件分析及优化原有基因序列，通过构建两种抗菌肽的双价酵母表达载体pPIC-Cec-Psd，将重组子转化毕赤酵母GS115，从而筛选出高拷贝数的理论上应该具有更好抑菌效果的重组子进行表达，并纯化重组酵母所分泌的外源蛋白，测定其对几种主要致病菌的MIC值，对重组酵母进行体外及在新疆几种特色水果上的生防效果验证，最后从细胞及分子水平上系统研究改造过的酵母抑菌机理，从而为其进一步大规模应用

由真菌病原菌引起的果实采后病害对人们造成了严重的经济损失。用拮抗酵母取代化学杀菌剂，或降低化学杀菌剂的使用量（即生物防治BCPD），具有良好的应用前景，但是普通拮抗菌很难达到化学杀菌剂的杀菌效果，因而筛选新型拮抗菌或提高原有拮抗菌拮抗效力成为了该领域的研究热点。通过基因工程技术改造拮抗酵母从而提高其生防效果是果蔬采后病害生物防治的新方法。本文探讨了将抗菌肽基因转移到酵母中表达以提高其生防效果的方法，成功的将外源抗菌肽基因Cecropin A 和 PsdI在毕赤酵母中进行共价表达并对重组酵母GS115/CEC-PSD对果蔬采后的主要致病菌和果蔬真菌病原菌引起的腐烂的抑制效果进行了研究；探讨了该酵母对果蔬采后病害抑制效果的影响；初步研究了该酵母对果蔬致病菌的抑制机理,其主要研究结果如下：.（1）根据已报道基因序列合成抗菌肽Cecropin A 和 PsdI基因片段，成功构建毕赤酵母表达载体pPIC/CEC-PSD，并转入 GS115中。筛选高抗性转化子，用Tricine-SDS-PAGE验证基因表达的正确性。并且经接种培养、诱导发酵及PCR鉴定等验证了重组酵母具有良好的稳定性。.（2）利用重组酵母对5种果实的5种主要采后致病菌进行了体外及体内生防实验：平板抑菌实验及液体抑菌实验均表明重组酵母在体外对病原菌有广谱抑菌活性；实验表明该重组酵母可显著抑制酸腐病原菌引起的柑橘的侵染；抑制扩展青霉引起的梨的腐烂；抑制灰葡萄孢引起的葡萄的腐烂；抑制褐腐病原菌引起的蟠桃的腐烂；抑制链格孢引起的番茄果实的腐烂。同时实验表明，重组酵母对病原真菌的抑制效力与其细胞悬浮液的浓度有关，浓度越高，对致病菌的抑制作用也越强。.（3）对重组酵母抑菌机理的研究结果表明，抑菌机制除体现了传统的营养与空间的竞争外，采用扫描电镜、透射电镜观察发现表达抗菌肽基因的重组酵母处理的真菌外部形态和内部结构都发生了很大的变化，出现了畸形，破裂，断残等现象。证实了其对真菌的膜结构及细胞内部结构的损坏作用。.（4）在以上工作的基础上，进一步从分子水平研究了表达抗菌肽基因的重组酵母对真菌的作用机制。凝胶阻滞实验证明，抗菌肽能与真菌的DNA结合，影响了它们在电泳中的迁移率，同时还能使真菌的DNA降解，因而真菌细胞的代谢过程受到破坏，最终导致了真菌的死亡。同时研究发现，抗菌肽CEC-PSD诱导酸腐病原菌的凋亡相关基因的表达。