聚酮类化合物埃博霉素多样化类似物生物合成的机制研究

The antitumor compounds epothilones are a kind of polyketides that are biologically synthesized by a hybrid complex of PKS and NRPS modules from some Sorangium cellulosum strains of myxobacteria. Up to now, 57 epothilone analogs have been identified in the So ce90 and So0157-2 producers. Among these analogs, only five basic compounds have the same structures between the two strains, while the others are different, showing diversity and complexity of the biosynthetic mechanisms for epothilones. In our previous work, we have identified 25 analogs of epothilones in the So0157-2 strain, finished the presently-only genome sequencing of epothilone producer, and achieved efficient expression of the big biosynthetic gene cluster in Myxococcus xanthus, the model species of myxobacteria with easy genetic performance. In this project, we are planning to investigate the potential module-skipping pattern and post-biosynthetic glycosylation of epothilones in M. xanthus host. The results have important meanings for insights into the biosynthetic mechanisms of diverse polyketide compounds produced by hybrid PKS/NRPS complexes, and provide guiding references for biosynthesis of novel epothilone compounds.

埃博霉素是粘细菌中纤维堆囊菌产生的一类具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物，由杂合的模块化PKS/NRPS合成。目前，从产生菌So ce90和So0157-2菌株中鉴定的埃博霉素类似物已达到57种，其中除了5个基本结构化合物完全相同外，其余均不相同，显示合成机制的多样性和复杂性。我们在前期的工作中，从So0157-2中鉴定了25种埃博霉素类似物，完成了目前唯一的埃博霉素产生菌的全基因组测序，并实现了在易于遗传操作的模式粘细菌黄色粘球菌中埃博霉素的有效异源表达。本申请拟在异源宿主粘球菌中研究埃博霉素类似物顺次加合合成过程中推测的跳跃式合成机制，以及埃博霉素合成后糖基化修饰的机制。研究结果对认识PKS/NRPS化合物多样化合成的机制具有重要意义，并为生物合成新型埃博霉素类化合物提供参考。

为了研究博霉素K合成中跳跃模块6的可能性，我们对模块6进行了敲除，但敲除菌株中没有检测到埃博霉素K的产生。但对模块6进行原位回补后，回补菌株恢复了埃博霉素A和B的产生能力，但仍然没有检测到埃博霉素K。我们进一步分析了模块6中三个必需结构域（KS、AT和ACP）的关键活性位点突变为丙氨酸，并检测突变后埃博霉素的产生情况，也没有检测到埃博霉素K。结果表明，我们在本源产生菌中发现的十四元环埃博霉素可能是通过其他机制合成。.为获得多样化的埃博霉素糖苷化合物，我们分析了若干产生菌本源以及外源的糖基转移酶在埃博霉素产生菌体内的糖基化活性，发现来自地衣芽孢杆菌的糖基转移酶YjiC酶等可以催化合成糖基化的埃博霉素，但测试的本源糖基转移酶未能糖基化埃博霉素。我们进一步从数据库中筛选并挖掘了高效的埃博霉素异源糖基转移酶，实现埃博霉素的体内/体外糖基化修饰，分离鉴定了埃博霉素葡萄糖苷，半乳糖苷，氮乙酰葡萄糖苷等一系列新型埃博霉素糖苷化合物，并初步分析了这些新化合物的抗肿瘤活性。这些新型埃博霉素化合物具有潜在的药用价值。.此外，我们对埃博霉素生物合成基因簇的上下游临近位置存在未知功能基因进行了分析。发现基因簇上游距离启动子约500 bp处存在一个未知功能基因esi 是作为一个转录调控因子通过结合埃博霉素基因簇启动子对整个基因簇的转录进行负调控。这是目前报道的第一个也是唯一一个埃博霉素转录调控子。发现基因簇的下游的ORFB基因编码一类C型β内酰胺酶，可以催化硝即噻吩开环。