粘细菌自有质粒pMF1复制和分配的遗传机制

粘细菌是研究原核生物细胞间信号调控和进化的重要模式生物，同时也是尚待开发的重要药源微生物类群。半个多世纪的粘细菌研究一直未能分离得到内源性质粒，而其他广宿主质粒均不能在粘细菌细胞中自主复制。有限的遗传操作技术极大地限制了粘细菌遗传学研究的开展。.2006年我们在国际上首次发现粘细菌的自有质粒pMF1。这是目前唯一在粘细菌中发现的自主复制质粒。本申请将在前期工作基础上研究pMF1质粒的复制和分配机制，内容包括复制蛋白和与复制蛋白相互作用的质粒序列确定，以及作用方式；影响pMF1质粒在子细胞中遗传分配的par基因系统和控制方式；构建基于遗传分配稳定的粘细菌高效遗传操作系统。

粘细菌具有复杂的社会学行为，并能产生丰富的次级代谢产物。pMF1 是目前发现的唯一的粘球菌内源质粒，构建遗传稳定的穿梭载体对于粘细菌研究具有重要的意义。通过逐段筛选，我们找到了能显著提高穿梭载体遗传稳定性的区域，位于nt 17242-50，并成功构建了稳定的穿梭质粒pZJY4111。该区域包含三个完整的orf及其位于上下游的两个iterons。通过生物信心学比对发现，pMF1.22与Sphingobium japonicum ParA-like 蛋白在氨基酸序列上有56%的相似度， 包含walk-type ATPase的四个保守模块，因此将pMF1.22命名为ParA。pMF1.21和pMF1.23没有比对到同源蛋白。DNase I footprinting和EMSA实验证实pMF1.23与上下游的两个iterons具有结合活性，对整个操纵子的转录有负调控作用，命名为ParB。pMF1.21没有DNA结合活性，但是能增强ParB的DNA结合活性和转录负调控作用，命名为ParC。荧光融合实验表明ParC在粘球菌DZ1中能自然表达，并且对宿主的生长速率和代时有一定的影响，具体机制仍不清楚。在pMF1上分散存在6个类iterons，虽然EMSA实验表明这6个类iterons与ParB均具有结合活性，但质粒稳定性实验表明只有位于启动子区内的ItA是必需的。综上结果表明pMF1的自主分配区域具有新颖性，不同于传统低拷贝质粒自主分配区域的基因模块组成和功能行使模式。Southern blot实验证明pMF1的复制方式为滚换复制，自主复制区是一个包含4个orf（pMF1.13-pMF1.16）的操纵子。pMF1.14是复制起始蛋白，没有典型的DNA结合结构域，但是含有丰富的重复序列。最小复制区约为370bp，位于pMF1.14内部，富含正向或反向重复序列。体内和体外实验均证实了pMF1.14与最小复制区的结合活性。自主复制区的特点可能是pMF1为严谨型的原因。