埃博霉素与其核心生物合成基因簇邻近基因关系研究

Better than paclitaxel, epothilones have been approved for first-line anti-cancer drugs. Epothilones only discovered from the Sorangium cellulosum, there are only 3 main strains reported in the world. So far, almost no study focused on the neighboring genes of the core epothilones biosynthetic gene cluster. So0157-2 is an epothilone producer isolated by our laboratory, we sequenced the biosynthetic gene cluster, and became the third one who owns the resources. Analyzing the neighboring genes, we found some possible modifiers in the upstream and in the downstream we found a possible resistance gene. Combined with the structures of the epothilones derivatives, we hypothesized that the upstream genes modify epothilones and the downstream gene degrades epothilones. This project focuses on the relationship study between epothilones and the adjacent genes of their core biosynthetic gene cluster: confirming the neighboring genes' functions, revealing relationship between those genes and epothilones, and offering new train of thoughts on obtaining new derivatives and avoiding the universal toxicity problem occurred in the heterogenous epothilones producers.

埃博霉素（epothilones）较紫杉醇更好，已被批准为一线抗癌药物。Epothilones唯一来源于纤维堆囊菌，国际上主要报道3例。至今，epothilones生物合成基因簇上下游潜在的功能基因及其与epothilones的关系研究几乎处于空白。So0157-2是实验室分离的具自主知识产权的epothilones产生菌，我们测序分析了其生物合成基因簇，是国际上第3例拥有该资源的实验室。分析发现基因簇上游存在可能的修饰基因，下游存在可能的抗性基因。结合已鉴定的epothilones衍生物结构，我们推测上游相关基因对epothilones具后修饰活性，下游相关基因对epothilones具降解作用，本申请围绕epothilones与其核心基因簇邻近功能基因关系展开：证实邻近功能基因的功能、揭示它们与epothilones的关系、并为新衍生物获得和异源表达普遍存在的细胞毒性问题提供新思路。

埃博霉素（epothilones）较紫杉醇更好，已被批准为一线抗癌药物。Epothilones唯一来源于纤维堆囊菌，国际上主要报道3 例。至今，epothilones 生物合成基因簇上下游潜在的基因及其与epothilones 的关系研究几乎处于空白。So0157-2 是实验室分离的具自主知识产权的epothilones 产生菌，我们测序分析了其生物合成基因簇，是国际上第3 例拥有该资源的实验室。分析发现基因簇上下游存在可能的epothilones关联基因。本项目围绕So0157-2来源的埃博霉素基因簇及其潜在关联的上下游基因与相关衍生物展开：首先对埃博霉素生物合成基因簇上游操纵子的调控区元件进行了精确定位与功能活性检测，揭示了基因簇操纵子的整体转录水平存在复杂的调控，包括：强弱双启动子，类似终止子的颈环结构，远端非编码区，以及与颈环结构互作的上游编码蛋白ESi等所共同调节，敲除“负调控蛋白及其颈环结合区”能够提高埃博霉素的产量，获得了高产4-5倍的改造株；其次优化构建了系列插入失活质粒，建立了优化的接合转移策略从而提高接合效率8-23倍，筛选获得了4种上下游基因插入失活的突变株，这些突变株的epothilones发酵产量较野生株显著提高3-6倍不等，证明了这些基因与epothilones生物合成代谢相关，获得了相对于野生菌高产的突变株。最后，研究了预测的甲基化酶和糖基化酶对埃博霉素的体外转化，其中筛选获得2个糖基化酶对epothilones的转化率几乎高达100%，对epothiloneB同时存在一次糖基化、二次糖基化和三次糖基化作用，从而衍生了多种糖基化的epothiloneB。综上，本项目揭示了埃博霉素基因簇操纵子的精确结构与多重调控；证明了邻近基因与埃博霉素存在相关性且能够降低埃博霉素主产物产量；鉴定到epothilone体外衍生物若干，为epothilone衍生物的获得提供了新思路；所收获的增产突变株与新型衍生物具备潜在的应用价值。