牛乳骨桥蛋白与乳铁蛋白协同成骨作用及热处理对其影响研究

牛乳骨桥蛋白（OPN）和乳铁蛋白（LF）可通过影响成骨细胞和破骨细胞的生长代谢过程而发挥成骨功能。有研究表明，在牛乳体系中LF与OPN具有很强的相互作用，以OPN-LF复合物形式存在，并且在LF免疫功能发挥过程中OPN起到重要的协同作用。然而对于两者协同成骨作用的研究却未见报导。热处理在乳及乳制品加工中是最为常见的操作单元，阐明热处理对于两者协同成骨功能的影响具有重要意义。因此本课题拟从影响成骨细胞生长分化的MAPK信号转导通路和影响破骨细胞凋亡的OPG/RANKL/RANK信号转导通路两个角度，阐明OPN与LF的协同成骨作用机制；同时采用不同温度和时间组合处理OPN与LF混合物，考察热处理前后OPN-LF复合物成骨功能的变化规律，进而阐明热处理对两者协同成骨作用的影响机制。该研究结果将为OPN和LF作为功能性成分在生产中应用的工艺开发奠定一定的理论基础。

乳铁蛋白(LF)作为一种新型的骨生长因子，目前相关应用基础研究备受关注。本研究以新鲜牛乳为原料通过SP Sepharose Big Bead阳离子交换层析及Superdex 200 凝胶层析组合方法、超滤浓缩等方法制备LF，纯度为94.71%。.本项目研究了LF对成骨细胞增殖活性影响的浓度范围。结果表明未加热LF能显著促进成骨细胞增殖，且在1-500μg/mL范围内呈剂量依赖关系。62-65℃加热处理低浓度LF（1-50μg/mL）对成骨细增殖作用无显著变化，而处理高浓度LF（1000-1500μg/mL）则会显著降低其活性；72℃加热处理LF对成骨细胞作用，作用24h时，低浓度（1、10μg/mL）对成骨细胞增殖作用显著提高，作用48、72h时则无显著变化，72℃加热处理高浓度LF（1000-1500μg/mL），作用24h、48h会显著降低对成骨细胞增殖作用，作用72h则无显著作用；85℃和95℃加热处理浓度高于100μg/mL LF都会显著降低对成骨细胞增殖作用。.同时，未加热LF能显著促进成骨细胞增殖，且在50～500μg/mL范围内呈剂量依赖关系；与未加热LF相比，经过65℃/30min和72℃/10s对于LF的活性几乎无影响；而LF分别经过85℃/10min和95℃/10min后对于其活性显著降低，而且热处理对高浓度的LF实验组影响较大。.本项目研究了热处理对LF的分子特性的影响。热处理参数设置为62～65℃/30min；72℃/10s；85℃/10min；95℃/10min。随着加热处理温度的升高，形成的蛋白聚集体粒径增大，即bLF发生自身热聚集的程度增强。另外，随着处理温度的增加，LF的α-螺旋构象逐步转变为β-折叠构象，蛋白质分子排列更为有序，分子的结构变得更加紧密，蛋白质分子发生变性趋势明显增加。表面疏水性分析表明，蛋白表面疏水性先降低再升高，接近变性温度时，疏水性达到最低。.本项目考察了LF对成骨细胞MAPK信号转导通路影响。研究表明：LF可通过介导ERK1/2、p38 MAPK、JNK亚通路来促进成骨细胞增殖，通过介导ERK1/2提高ALP活性。不同加热处理LF则通过介导ERK1/2、p38 MAPK、JNK亚通路抑制成骨细胞增殖和ALP活性。.本研究通过阐述热处理对LF结构、性质及促成骨细胞增殖活性的影响，为LF相关产品开发奠定了理论基础。