乳铁蛋白片断与氟康唑协同作用的机理研究与应用研究

Due to the copious application of broad-spectrum antibiotics and immunosuppressive agents, and the widespread usage of invasive diagnostic and therapeutic devices, the incidence of Candidiasis has been increasing year after year. The treatment of infection by drug-resistant Candida spp has become a challenge clinically. In our previous investigation, we observed an inhibitory effect of lactoferrin fragments on C. albicans, and have delved into the inhibitory mechanism of these lactoferrin fragments. At the same time, we found that these fragments could exert a synergistic antifungal action with fluconazole and the fragments could suppress Candida spp initially resistant to fluconazole. The aim of this project is to ascertain the mechanism of synergism between lactoferrin fragments and fluconazole, and to compare this mechanism with that exerted by lactoferrin fragment alone. We anticipate to find out the differences in mechanism of action. In addition, we plan to use a mouse model for studying, from the perspective of pharmacokinetics, the condition of metabolism of these peptide fragments in vivo, and then use this mouse model for investigating the synergism between the fragments and fluconazole in vivo. Finally, we plan to prepare a conjugate between a lactoferrin fragment and a fluconazole using disulfide bond and test the antifungal activity of this conjugate. This would open up a new area of research and development for new antifungal drugs.

随着广谱抗生素，免疫抑制剂的大量使用，和各种入侵性微创诊疗的广泛使用。念珠菌感染的个案逐年增加，特别是耐药真菌感染的治疗已成为困扰临床的棘手问题。我们在前期的研究中发现了乳铁蛋白的片断对念珠菌有抑菌活性，并对这些肽片断的抑制机理进行深入的分析。与此同时，我们还发现这些肽片断还可以与氟康唑有协同抑菌作用，一起使用可以抑制原本对氟康唑耐药的念珠菌菌株。所以本次立项目的在于寻找出乳铁蛋白的片断与氟康唑的协同作用的机理，可以通过与之前我们研究的单用乳铁蛋白的片断进行抑菌的作用机理相比较，希望找出不同的作用机理。此外，我们还计划利用小鼠模型从药代动力学角度研究这些肽片段在体内的情况，然后再利用小鼠模型进行肽片断与氟康唑体内协同作用的研究。最后，我们还计划将氟康唑用二硫键与一个肽片断连接成化合物，并测试该类化合物的抗菌活性。这样可以为抗真菌新药的研发开辟一条新路。

随着广谱抗生素，免疫抑制剂的大量使用，和各种入侵性微创诊疗的广泛使用。念珠菌感染的个案逐年增加，特别是耐药真菌感染的治疗已成为困扰临床的棘手问题。本项目针对该问题提出了利用抗菌多肽Lfcin加上氟康唑的混合抑菌的方法。首先，我们成功合成了左旋和右旋的Lfcin 和Lfampin并且进行了Lfcin和Lfampin的药代动力学实验。结果显示左旋与右旋的多肽其在小鼠体内的只能维持不到半个小时。在多肽与氟康唑协同作用的研究方面，我们发现Lfcin与氟康唑的协同效应（FIC=0.57）比Lfampin与氟康唑的协同效应（FIC= 0.73）要强，其协同效应主要体现在对临床耐药光滑念珠菌（11B67479-5），对于白色念珠菌（SC5314参考菌株）和光滑念珠菌（ATCC90030参考菌株）不明显。在研究协同机理时，我们将研究对象锁定Lfcin和氟康唑，菌株采用耐药光滑念珠菌（基因表达差异性研究使用的是ATCC90030菌株）。在Lfcin和氟康唑混合物小鼠体内抗菌测试中，混合物在小鼠体内任然有抗菌能力，虽然多肽Lfcin在小鼠体内的半衰期很短。在RNA-seq的基因表达差异的分析中，我们发现经过Lfcin和氟康唑混合物处理后的真菌其多数代谢基因的表达发生了上升或下降的变化。我们最后一个研究目标是将氟康唑粘贴到多肽Lfcin上形成化合物。首先，我们计划通过氟康唑羟基-氨基酸羧基缩合形成酯的方法进行贴合。可是由于位阻效应，此反应效率太低。之后，我们借助于波兰合作者的帮助，利用他们的Click Chemistry的方法方合成Lfcin 和氟康唑的化合物。可惜该化合物的抗菌性（MIC）无法与单个Lfcin或氟康唑比较。综合来看，Lfcin和氟康唑有一定的协同效应，而且该协同效应存在于小鼠的体内实验。其协同效应与该两者混合物可以影响真菌的代谢有关。不过，将两者分子结合成化合物后，其抗菌活性将大大降低。