假单胞菌中多组份2-氯硝基苯双加氧酶特性及其表达调控研究

在我们前期工作中，分离到一株2-氯硝基苯（2-CNB）降解菌施氏假单胞菌ZWLR2-1，并从分子生物学水平阐明了该菌经 3-氯邻苯二酚中间产物降解 2-CNB的代谢途径。在转座子作用下，2CNB代谢基因簇可能由萘双加氧酶基因簇和3-氯邻苯二酚邻位开环途径基因簇（cnbCDEF）拼装进化而来，原本需诱导表达的环羟化双加氧酶基因变成为组成型表达。然而在2CNB代谢途径进化过程中，相关代谢基因的表达调控机制，以及微生物如何通过适应性进化扩大底物利用范围的分子机理尚未阐明。本申请拟通过研究2CNB降解基因簇转录启动子，以及测定2CNB双加氧酶的动力学参数、底物范围和捕获可能的反应中间产物，阐明2CNB代谢基因簇的表达调控机理及2CNB双加氧酶的作用机制。该研究将完善2CNB代谢途径，有助于充分理解微生物代谢途径的多样性的分子机理，以及微生物适应环境污染物的快速进化机制。

1.通过2CNB 降解基因簇与其它相关代谢基因簇的比较，推测该基因簇由起源于萘双加氧酶基因簇的部分基因cnbAcAd和3-氯邻苯二酚邻位开环途径基因簇（cnbCEFAbAaD）拼装进化而来，然而原本存在于萘双加氧酶基因簇的转录调控基因未在2CNB降解基因簇中发现。2CNB降解基因簇是如何转录调控有待研究。本课题阐明了野生菌施氏假单胞菌ZWLR2-1中2CNB代谢基因簇的转录是由多个组成型启动子共同完成的。 2CNB降解基因簇的所有基因可以以一个转录单位共转录，在这段DNA片段上检测到3个启动子区域，推测2CNB降解基因簇上可能存在多个转录单元。P1启动子位于2CNB降解基因簇5′端，启动2CNB降解基因簇的转录， P2和P3启动子位于2CNB降解基因簇的内部，加强2CNB基因簇中cnbAcAd基因的表达。P3启动子区域的-35区序列对启动子活性有明显影响。而这个-35区正是位于18bp的直接重复序列中，这意味着18bp的直接重复序列进化有利于增强启动子活力，从而使微生物提高降解环境污染物的能力。该研究有助于了解细菌适应环境污染物的快速进化机制（Gao et al, submitted）. .2.从革兰氏阳性菌3-硝基苯降解菌红球菌ZWL3NT（Rhodococcus sp. strain ZWL3NT）中克隆ntdA1A2A3A4基因并鉴定其功能。该酶与来自革兰氏阴性菌假单胞菌ZWLR2-1（Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1）2-CNB双加氧酶的氨基酸序列差别很大（22%-33%），但功能相似，都能将2-CNB转化为3-氯邻苯二酚，然而当转化3-硝基甲苯时形成的产物有差别。2-CNB双加氧酶转化3-硝基甲苯生成3-甲基邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚，而3NT双加氧酶转化3-硝基甲苯仅生成3-甲基邻苯二酚，即3NT双加氧酶对芳烃化合物的羟化反应是区域专一性（regiospecificity）。该研究从分子生物学和生物化学水平阐明了3-硝基甲苯降解的第一步羟化反应机理，以及芳烃化合物降解的多样性。