铜绿假单胞菌中CpxR-CpxA双组份系统对耐药性的调控作用

Pseudomonas aeruginosa, one of the most prevalent opportunistic human pathogens, exhibits innate resistance to multiple antimicrobial agents. In previous work, we have found, for the first time, CpxR-CpxA two-component system activates the expression of mexAB-oprM operon, encoding clinically predominant RND efflux pump, subsequently causes multidrug resistance in P. aeruginosa. In this project, we plan to identify the environmental and physiological signals which stimulate the activity of CpxR-CpxA as well as the relationship between the occurrence of resistome and CpxR-CpxA, further characterize their impacts on multidrug resistance in P. aeruginosa. This project is going to elucidate a novel mechanism of occurrence of multidrug resistance in P. aeruginosa and may provide important guideline for the drug resistance analysis in clinical setting.

铜绿假单胞菌是人类三大条件致病菌之一，对多种抗生素具有天然的抗性。在前期工作中我们首次发现铜绿假单胞菌CpxR-CpxA双组份调控系统能直接激活临床上最为重要的RND多药外排泵MexAB-OprM操纵子的表达，显著提高对多种抗生素的抗性。在本项目中，我们将确定激活铜绿假单胞菌CpxR-CpxA双组份调控系统的上游环境及生理信号，将分析铜绿假单胞菌的耐药组（Resistome）的出现与CpxR-CpxA双组份调控系统的关系，同时分析这些生理信号及遗传变异对铜绿假单胞菌耐药性的影响。本项目将揭示铜绿假单胞菌耐药性产生的新机制，对临床耐药性分析具有重要的指导意义。

近年来，在多种病原微生物的耐药性研究中，耐药组（resistome）引起了广泛关注。耐药组研究的进深科学问题是这些功能不同的基因突变通过哪些信号转导途径引起细菌的多重耐药性。CpxR-CpxA双组份系统在多种细菌中介导多种细胞外周胁迫。我们在前期工作中发现，在铜绿假单胞菌中CpxR可以直接激活MexAB-OprM多药外排泵的表达。本项目中，我们分析了多种抗生素处理铜绿假单胞菌产生依赖CpxR的多重耐药性，发现CpxR能促进抗生素在抑制浓度下和亚抑制浓度下引起铜绿假单胞菌群体产生多重耐药的过程。我们筛选到4株依赖CpxR的nalB类铜绿假单胞菌多重耐药突变株，进行了全基因组序列分析，发现cpxA基因的一个单氨基酸突变，能引起多重耐药性。从CpxA易错PCR随机突变库中，我们筛选到位于CpxA蛋白的不同功能结构域的13个氨基酸位点的突变，都能引起多重耐药。我们的工作揭示了cpxA是铜绿假单胞菌重要的耐药组基因。另一方面，我们也分析了哪些生理或遗传信号通过CpxR-CpxA双组份系统，调节MexAB-OprM外排泵的表达水平以及细胞耐药性。我们发现CpxR-CpxA双组分系统介导高浓度氯离子的信号，并引起MexAB-OprM外排泵的表达水平升高。考虑到在铜绿假单胞菌中CpxR-CpxA双组份系统所调控的生理表型明显区别于大肠杆菌等其他细菌，我们利用RNA-seq进行了转录组学分析。我们发现CpxR-CpxA双组份系统不仅能调控外排泵基因mexAB-oprM和muxABC-opmB的表达，也能调控与致病表型相关的铁载体pyoverdine合成基因簇（pvd）和type-4 pilus合成基因簇（pil）的表达。通过SD大鼠感染模型，我们进一步确认了CpxR-CpxA双组份系统参与调控铜绿假单胞菌的致病性。