靶向求源探索Dhcr7基因沉默影响腭胚突融合的机制及防治的基础研究

胆固醇是动物组织细胞不可或缺的物质。Dhcr7基因突变将导致胆固醇代谢紊乱，并发生包含腭裂在内的颅面畸形。应用Dhcr7基因打靶模式动物研究了Dhcr7基因在胚胎发育中可能的功能作用，但存在争论。Dhcr7基因打靶模式小鼠存在腭裂表型，但Dhcr7 基因对腭突融合的调控机制未见报道。为研究其在腭突融合中的功能作用，本课题应用构建Dhcr7基因沉默小鼠胚胎腭突模型从器官水平、通过腭突间充质细胞培养从细胞水平对比研究Dhcr7基因调控腭突融合的机制。同时研究了Dhcr7在腭突发育中的时空表达及可能参与的信号通路的筛选。应用添加不同浓度外源性胆固醇观察研究了其对Dhcr7基因沉默小鼠腭突融合的促进作用及机理。最终阐明Dhcr7基因在胚胎腭突融合过程中的分子调控机理，为最终明确影响腭突融合的完整信号通路的网络化调控提供理论根据，为开拓先天性腭裂高危人群的干预性治疗的新途径奠定基础。

本课题在国家自然基金委资助下，现已经全部完成立项时所拟定的指标。我们研究了小鼠胚胎腭突发育过程中Dhcr7基因的时空表达及表达量变化，随后通过腺病毒介导RNA干扰技术研究了抑制Dhcr7基因对腭突发育融合的影响，最终通过腭突器官培养、外源性胆固醇添加的方式研究证实Dhcr7基因在腭突发育中参与到Shh/Bmp2信号通路发挥作用。本课题严格按照项目立项书中所研究的任务指标进行，达到了研究目的。目的：研究7-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr7）对腭突发育融合的影响，及其参与的音猬因子（Shh）信号通路的研究。方法：1：取E13.5、E14.5和E15.5天的小鼠胚胎的腭突,免疫组织化学观察Dhcr7蛋白、mRNA在腭突中的表达定位。2：取E13.5天的腭突进行体外培养，随机分为正常对照组、阴性对照腺病毒组和siDhcr7-腺病毒组，培养48h后分别提取总RNA、总蛋白，进行组织染色、扫描电镜和RT-PCR、WB分析；siDhcr7-腺病毒组于48h后更换培养基随机分为四组分别添加0ng/ml、200ng/ml、400ng/ml和600ng/ml浓度的胆固醇，继续培养72h后，SEM和组织染色观察融合情况。3：取E13.5天腭突进行培养，分为空白对照组、siDhcr7-腺病毒组和Dhcr7抑制后加胆固醇组，前两组于培养48后更换不含胆固醇培养基，最后一组更换含有600ng/ml胆固醇培养，继续培养72h后分别行组织染色和SEM观察形态变化；分别提取总RNA和总蛋白质应用RT-PCR和WB检测Dhcr7、Shh和Bmp2表达量的变化。结果：1. Dhcr7主要表达在EPM细胞，E15.5的Dhcr7mRNA及蛋白表达量与E13.5和E14.5差异有统计学意义（P＜0.05）。2. siDhcr7-腺病毒组Dhcr7的mRNA和蛋白表达量与正常对照组和阴性对照组相比，差别有统计学意义(P＜0.05)；添加梯度胆固醇后，只有600ng/ml组腭突融合，其余组均没融合。3. Shh和Bmp2在siDhcr7-腺病毒组的mRNA和蛋白质的表达量随着Dhcr7表达量降低而降低。结论：Dhcr7在腭突发育中的关键阶段有表达，并且表达量与其生长发育有密切关系；抑制Dhcr7在腭突中的表达，能抑制腭突的融合,添加胆固醇能逆转其抑制作用；Dhcr7参与Shh/Bmp2信号通路发挥作用。