PPO基因在双孢蘑菇褐变中的功能研究

Agaricus bisporus is one of the most important cultivated mushrooms in the world. The fruitbodies of mushrooms easily become brown in a few days during postharvest, which can lead to considerable economic losses. Rapid postharvest browning of A.bisporus is recognized as a severe problem in the mushroom production. The polyphenoloxidase (PPO) is the key enzyme responsible for the mushroom browning. The enzyme catalyzes the oxidation of phenols into brown pigments, giving the eventual dark colour on the caps. The mechanisms of PPO gene expression and regulation can be studied to seek for new methods to inhibit PPO activity with the eventual aim to improve the quality and duration of mushroom storage. In previous work, two PPO genes, AbPPO3 and AbPPO4 were successfully isolated, which are reponsible for mushroom browning during postharvest storage. To understand the biological function of PPO involved in the browning process and how to control the PPO browning, studies on the details of expression and function of PPO are needed. In this study, the AbPPO3 and AbPPO4 promoters were fused with GUS gene to identify the expression patterns of the two PPOs. the functions of the A.bisporus PPO were determined by antisense RNA and overexpression techniques. The relationship between the expression level of PPOs and the browning rate of mushrooms will be examined. Reasearch on the functions and expression of PPO genes may help decipher the molecular mechanism of the mushroom browning, and can provide information for genetic engineering of mushroom to prevent postharvest browning in A.bisporus.

双孢蘑菇是我国主要栽培食用菌。双孢蘑菇采收后极易褐变，品质及商品性急剧下降，已成为困扰产业发展的突出问题。多酚氧化酶（PPO）活性是造成双孢蘑菇褐变的关键因素，PPO通过氧化酚类生成褐色物质，使菇体变暗腐烂。因此，揭示双孢蘑菇褐变中PPO的作用机理，对调控PPO活性、抑制酶促褐变，具有重要意义。本项目组在前期研究中，已克隆到2个PPO基因，AbPPO3与AbPPO4，基因表达分析表明此2个基因与双孢蘑菇褐变相关，同时还建立了农杆菌介导的双孢蘑菇转化体系。本项目以双孢蘑菇为研究对象，通过启动子与GUS融合表达确定基因的表达方式，利用PPO反义抑制与超量表达方法验证基因的功能，分析AbPPO3及AbPPO4基因表达与褐变的关系，系统研究PPO基因的功能及其在褐变过程中的作用。通过本项目研究，不仅有助于揭示双孢蘑菇褐变的分子机理，也为双孢蘑菇抗褐变分子育种开辟新途径、新思路，具有重要的创新意义。

本项目按照研究计划顺利进行，并拓展和增加了部分研究内容。本项目在国家基金的资助下深入研究了PPO基因在双孢蘑菇褐变中的功能，通过荧光定量PCR技术研究双孢蘑菇采后褐变和发育PPO基因的表达模式表明，PPO基因各成员均为诱导型表达，在发育及不同储藏时期，AbPPO3/4/5表达量较高，具有极为相似的表达规律，在子实体分化发育的早期、菌柄、菌盖、菌褶和孢子的成熟中起着主要作用， AbPPO1在整个发育时期表达量都处于较低水平；AbPPO3/4/5基因在双孢蘑菇褐变过程中随着储藏时间延长而表达量逐渐降低，AbPPO1基因在褐变的晚期表达量达到最高，表明PPO基因在发育尤其是在采后储藏中起着重要作用，AbPPO3/4/5基因在采后褐变和发育中可能具有相似的功能；建立和完善了双孢蘑菇高效转基因体系，通过AbPPO3、AbPPO4基因启动子融合双元表达载体PCghG中的GUS基因在双孢蘑菇中表达，首次发现植物激素ABA、SA对双孢蘑菇PPO启动子的诱导作用；利用双孢蘑菇中反义抑制AbPPO3、AbPPO4和过量表达表达方法分析PPO基因功能，研究表明在双孢蘑菇中转入反义PPO基因，可显著降低PPO酶活性水平，转基因蘑菇抗褐变品质明显改善，反之过量表达PPO基因使双孢蘑菇PPO酶活性增强和褐变程度加深。在完成基金项目原定研究内容的基础上，为进一步探索PPO基因的功能及可能存在的调控机制，我们利用高通量测序技术对双孢蘑菇针头期、闭杯期和大开伞期等不同发育时期进行了转录组分析，共筛选到6328个差异表达基因，其中3941个上调基因，2387个下调基因，其中差异基因主要富集在氨基酸代谢通路中，氨基酸合成相关多数基因具有比较活跃的上调表达，表明氨基酸代谢相关基因可能在双孢蘑菇子实体发育过程中起重要作用，转录组数据的获得为进一步理解PPO基因功能及褐变调控分子网络奠定了提供了基因数据资源，拓宽了未来研究思路。