麦角硫因对采后双孢蘑菇褐变进程的调控及作用机理

Ergothioneine (ERT), a naturally occurring amino acid, showed high potential of antioxidative activity in vivo and vitro, however, its application to foods and foodstuffs is still limited. Our preliminary experiment found ERT can effectively control the postharvest browning of button mushroom (Agaricus bisporus) during storage, but the mechanisms involved are still unknown. On the basis of preliminary work, the present project is designed to use ERT as a anti-browning agent for pre-treating button mushroom, the research is conducted to: (1) Evaluate the antioxidative efficacy of ERT in vitro, and its effect on preventing browning and quality deterioration of button mushroom during storage; (2) Research the enzymatic reaction characteristics of browning enzymes as well as substrate under ERT treatment, tracking the browning evolution from microscopic view, and make clear the physiological and biochemical mechanisms of ERT on inhibiting mushroom browning; (3) Screen differentially expressed genes between normal and browning mushroom tissue by suppression subtractive hybridization (SSH), northern blot, or fluorescence quantitative PCR, and reveal the molecular and biological mechanisms of ERT on inhibiting mushroom browning. The research results are important for the development of ERT as a natural preservative (anti-browning agent) for fruits and vegetables.

麦角硫因是一种天然氨基酸，在维持生物体系氧化－还原平衡、抗氧化损伤及作为食品添加剂等方面具有重要的应用价值，而国内对其研究还处于探索阶段。我们的前期研究表明，麦角硫因对采后双孢蘑菇的褐变有明显的抑制作用，但其调控机理尚不明确。本项目在前期工作的基础上，拟采用麦角硫因作为防褐剂处理采后双孢蘑菇，主要内容有：（1）系统评价麦角硫因体外抗氧化功效，阐明其调控双孢蘑菇褐变及品质变化的时间和空间规律；（2）应用谱学技术、显微技术等现代分析手段，研究麦角硫因作用下褐变酶类与底物的酶学反应特性，从微观角度跟踪褐变的形成及演变，明确麦角硫因抑制双孢蘑菇褐变的生理生化机制；（3）利用抑制差减杂交方法、Northern Blot 或荧光定量PCR技术，分析基因转录谱差异，研究褐变差异基因的表达模式，揭示麦角硫因抑制双孢蘑菇褐变的分子生物学机制。项目的研究结果为麦角硫因作为天然果蔬保鲜剂的开发具有重要意义。

褐变是影响双孢蘑菇品质的主要因素。本文以双孢蘑菇(Agaricus bisporus)AS2796为实验材料，研究不同浓度（0.03，0.06，0.12mM/L）外源麦角硫因预处理对采后双孢蘑菇贮藏期间主要品质的影响，筛选适合双孢蘑菇贮藏的麦角硫因处理浓度，并从酚类含量及其形成的关键酶活性、多酚氧化酶活性、细胞膜完整性、活性氧代谢。等方面探究麦角硫因对采后双孢蘑菇褐变抑制的可能性机制。还测定了双孢蘑菇多酚氧化酶的最适底物。为进一步开发麦角硫因在果蔬保鲜上的应用提供理论依据。.主要结果如下：.1.麦角硫因处理对采后双孢蘑菇具有减缓褐变和延长贮藏时间的作用，本实验中使用的麦角硫因处理浓度越高，其护色效果越好。且处理不仅能改善表面褐变，对内部组织的褐变抑制也有较好的效果。此外，麦角硫因处理也能一定程度上维持双孢蘑菇的硬度，减缓抗坏血酸含量的下降，且含有较高的可溶性固形物和可溶性蛋白含量。总体上看，麦角硫因处理对维持双孢蘑菇的营养品质也有一定效果。.2. 麦角硫因处理提高了贮藏前期超氧化物歧化酶（SOD）活性；降低了多酚氧化酶（PPO）活性；还降低了膜脂过氧化程度和细胞膜渗透率，维持了膜系统结构和功能的完整，延缓了菇体的衰老；能减缓早期总酚含量的下降，但对酚类物质的合成没有影响作用，对O2•-或H2O2亦没有直接清除作用。.3.用HPLC测定双孢蘑菇的酚酸物质，发现与褐变密切相关的底物可能为对羟基苯甲酸和没食子酸，结合前人报道一并测定了双孢蘑菇PPO的4种底物的米氏常数得到：L-酪氨酸<儿茶酚<对羟基苯甲酸<没食子酸。没食子酸的Km最大且远大于前面三组。为此，双孢蘑菇PPO最适底物可能为L-酪氨酸、儿茶酚及对羟基苯甲酸。.4.麦角硫因处理提高了采后双孢蘑菇细胞内ATP的含量和利用率，增强了线粒体内膜能量代谢关键酶H+-ATPase、Ca2+-ATPase和琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，维持了双孢蘑菇在贮藏期间的能荷水平，保障了采后双孢蘑菇进行各项生理代谢的能量供应。.5. 麦角硫因处理降低了采后双孢蘑菇在贮藏过程中多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性，并且降低了多酚氧化酶相关基因中PPO_1、PPO_3、PPO_5基因和苯丙氨酸解氨酶相关基因中PAL_1、PAL_2基因的相对表达量，同时增强了双孢蘑菇细胞内PPO_2和PPO_6基因