TGF-β1甲基化在类风湿性关节炎Th17/Treg细胞分化平衡中的作用机制研究

TGF-β1 is a poly-functional factor, however，it has an obscure function in Rheumatoid arthritis (RA). This project wants to explore the role and molecular mechanisms of TGF-β1 methylation in the pathogenesis of RA by following experiment. we have detected and compared the methylation extent of TGF-β1 promoter in PBMC samples between patients and healthy people，and got the relationship with the TGF-β1 mRNA and protein expression level. The following experiment we will get the methylation difference CpG locus by MS-PCR，and use CRISPR/dCAS9 technology to explore how the TGF-β1 methylation difference CpG position regulates the balance of Th17/ Treg cells differentiation. Then we will analyze the impact of different concentration TGF-β1 with IL-10 or IL-6 on Th17/ Treg cells differentiation. At last，we get some transcriptional regulation factors which binding the hot methylation locus of TGF-β1 promoter by EMSA method，and get some information by SDS-PAGE and western-blotting technology. In all，we wish to clarify the relationship of TGF-β1 methylation state and RA，and find some related transcriptional regulation factors which binding and regulate the methylation extent of TGF-β1 promoter，these results can support the theoretical basis for finding the mechanism of causing and healing RA.

TGF-β1是一种多效能细胞因子，参与Th17/Treg细胞可塑性分化，影响类风湿关节炎（RA）发生与发展，但具体作用不清楚。前期研究发现RA患者和健康人群PBMC中TGF-β1基因启动子的甲基化程度差异显著，与TGF-β1 mRNA 及其蛋白表达相关，且与RA病理程度相关。所以TGF-β1甲基化差异与 RA中Th17/Treg细胞分化平衡紊乱关系值得探讨。本项目拟运用MS-PCR方法比较检测甲基化差异CpG位点，然后运用CRISPR/dCAS9技术融合TET1定位修饰TGF-β1差异甲基化CpG位点，分析此位置与Th17/Treg细胞分化平衡的关系。最后运用EMSA方法分离与TGF-β1基因启动子热甲基化位点结合的相关转录调控因子，分析此因子的生物学特点,研究此因子如何通过转录调控因子参与对RA的调节。以上研究对以后利用TGF-β1作为靶点在RA诊断和治疗方面提供了重要理论依据。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀性对称性多关节炎为主要临床表现的慢性全身性自身免疫性疾病。RA的病因和发病机制极为复杂，其中Th1/Th2/Th17/Treg细胞的分化平衡影响RA的发生与发展。而转化生长因子TGF-β1参与Th17/Treg细胞的可塑性分化。前期发现RA患者和健康人群PMBC中TGF-β1启动子甲基化程度有差异，但TGF-β1与RA关系及其具体作用不清楚。.因此我们进行了三个方面的研究。第一，利用RFLP-PCR方法检测了正常人群和RA患者血液细胞TGF-β1 第一个外显子 +869T/C 的单核苷酸多态性，并统计分析其和RA易感性的相关性。第二，利用FCM方法和ELISA方法分别检测了高活动期和低活动期RA患者外周血中Tfh细胞和血清中细胞因子TGF-β1的水平，并统计分析两者的相关性。第三，利用MS-PCR比较检测了正常人群和RA患者血液细胞TGF-β1甲基化差异情况，并利用JASPAR和UCSC数据库预测分析了TGF-β1甲基化差异CpG位点结合的转录因子情况。.研究结果表明，RA患者和正常人群相比，结果一，TGF-β1 第一外显子 +869T/C位点基因型频率有显著差异，+869 CC基因型比为 (17.3% vs 32.7%)，+869 TT基因型比为 (29.3% vs 20.7%)，可见CC基因型是RA的易感基因型。结果二，外周血中Tfh2和Tfh17细胞数有显著差异，血清中IL-6，IL-17，TGF-β1 和MMP-3蛋白表达有显著差异，而且IL-6，IL-17和MMP-3蛋白水平与Tfh2和Tfh17细胞数成正相关，TGF-β1蛋白水平与Tfh2和Tfh17细胞数成负相关。结果三，外周血中Th1、Th17和Treg细胞数有显著差异，Th2没有。TGF-β1 mRNA表达在不同期RA患者中有显著差异，血清TGF-β1蛋白水平差异不一。Th17和TGF-β1 mRNA分别和RA DAS28具有较好的正负相关性。TGF-β1启动子甲基化差异与RA具有显著相关性，分析预测转录因子有ZNF16，NHLH2，PBX3，CTCF，PKNOX1，GLIS2和KLF4七个，其中ZNF16结合调控转录活性最好。.以上结果对以后利用TGF-β1作为靶点在RA诊断和治疗方面提供了重要理论依据。