基于发现和靶向蛋白质组学的Harpin蛋白调控欧洲花楸生物胁迫响应的机制研究

Harpin proteins encoded by hrp genes are bacterial protein elicitors, which can induce plant growth and the formation of phytoalexin in particular as well as the hypersensitive reaction (HR), defense responses to biotic stress. However, how plants respond to biotic stress via HR and phytoalexin caused by harpin proteins is still unclear. Previous reports have shown that the biphenyl compounds from the Sorbus aucuparia suspension cells (SASC) was significantly increased under biotic stress. In this study, harpin-treated model was built and 1) the changes of physiological and biochemical characters of SASC were detected; 2) the secondary metabolites in SASC was explored, especially the quantitative analysis of the key enzyme, which control the synthesis of biphenyl; 3) we present a discovery study of HR that combines complementary quantitative iTRAQ-based proteomics. As such, this model could provide an additional opportunity for explain the functions of harpin as both a defense activator and plant growth promoter. It is worthy of mining SASC resistance characteristics and application advantages, so that can be widely and effectively utilized in plant stress studies.

产生植保素和过敏反应是植物抵御胁迫的重要方式。Harpin蛋白是一类由革兰氏阴性病原菌hrp基因编码的蛋白，能诱导非寄主植物产生植保素和过敏反应，但其调控机制尚不明确。本项目在前期发现生物胁迫对欧洲花楸悬浮细胞中联苯类植保素累积有刺激作用基础上，用Harpin蛋白处理欧洲花楸，开展研究：1）检测处理和对照组激素水平、信号转导、联苯类植保素及其他次生代谢产物变化，观察Harpin刺激后的适应性反应；2）考察联苯类植保素生物合成途径中关键酶BIS、OMT1、B4H和OMT2在转录水平和蛋白水平的表达情况，明确Harpin蛋白对植保素合成的影响机理；3）建立处理和对照组过敏反应相关蛋白的差异表达谱和作用网络，揭示Harpin蛋白介导过敏反应影响抗逆性的规律。项目旨在阐明Harpin蛋白调控欧洲花楸响应生物胁迫的机制。项目成果对药用植物生态种植、精准调控、抗逆育种和道地品质形成具有实际指导意义。

欧洲花楸中含有较丰富的黄酮、联苯类、萜类等成分，具有镇平喘、抑菌和抗氧化作用，也是良好的园林观赏树种，应用前景广阔。欧洲花楸抗逆性强，对生物胁迫敏感；植物革兰氏阴性病原菌中hrp基因编码的harpin蛋白，作为生物诱导子，能影响寄主植物的致病性和非寄主植物的抗性，其作用机制不明确。本项目利用harpin蛋白作为外源诱导子处理欧洲花楸悬浮细胞，作用不同时长，通过分析，得到了以下主要结论：1）harpin蛋白对欧洲花楸悬浮细胞的生物量影响不明显；harpin蛋白刺激欧洲花楸后，其体内的抗氧化物酶表达量增加。2）欧洲花楸悬浮细胞在响应harpin蛋白初期（6h）、中期（12h）和后期（24h），和对照组相比较，联苯类植保素noraucuparin、noraucuparin 5-O-β-D-glu、noraucuparin 4-O-β-D-glu和aucuparin含量变化明显，并在后期达到峰值。3）蛋白质水平变化是从初期通过上调表达液泡分选蛋白受体、CCCH型锌指蛋白和多蛋白桥梁因子，调节对含氧化合物响应的生物学过程，应对harpin蛋白胁迫。中期通过上调表达液泡蛋白分选受体、丙酮酸脱羧酶、WRKY转录因子33、WRKY转录因子40、ABC转运蛋白、patatin样蛋白（PLP2）蛋白，启动水杨酸的合成和代谢途径，启动系统获得性抗性等生物学过程来应对胁迫。后期体内的差异蛋白主要富集在细胞饥饿响应过程、对外界刺激的响应等过程；由水杨酸介导的PR1蛋白表达量显著增加；欧洲花楸通过大量表达联苯类植保素合酶，合成植保素应对胁迫。4）aucuparin合成通路上关键酶BIS，OMT1，OMT2和B4H，在转录水平上和蛋白水平上的表达随诱导时间的长短而呈现出不同的变化规律。5）通过PRM技术，对处理24h筛选到的差异蛋白进行质谱验证。结果显示，基于PRM技术的蛋白定量结果与iTRAQ定量蛋白表达趋势一致。综上所述，基于质谱的蛋白质组学技术为我们研究复杂体系下，蛋白质组的变化情况提供了强有力的技术支持。欧洲花楸悬浮细胞响应harpin蛋白的生物胁迫的研究，是中药材生态农业中基于“逆境效应”理论的生态种植的典型代表，为该领域的相关研究提供了技术和理论参考。