杂交鹅掌楸体胚发生体系的比较蛋白质组学研究

体细胞胚胎发生技术是木本植物快速高效繁殖的重要手段，为进一步提高体胚发生频率，实现从生理生化水平对体胚发生过程的调控，需要对体胚发生的机理进行深入探讨。本研究以高频发生的杂交鹅掌楸体胚发生体系为材料，以比较蛋白质组学方法研究体胚发生过程中蛋白质的表达规律，即以非胚性细胞、胚性细胞、早期原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚、体胚再生植株等为研究材料，通过荧光双向差显凝胶电泳技术（DIGE）筛选体胚发育过程中差别表达蛋白，结合差别表达蛋白点的串联质谱分析和植物蛋白库和杂交鹅掌楸物种特异的多肽库进行蛋白质鉴定，以确定与体胚发生紧密相关的蛋白及代谢途径。并结合Western杂交、RT-PCR技术、生理生化测定和转基因等手段进行验证。综合转录组和功能基因组的研究成果揭示体细胞向胚性细胞转型期、早期原胚形态建成期、体胚成熟及萌发期等几个关键时期细胞的基因和蛋白质的表达变化，推测体胚发生机理。

鹅掌楸作为中国南方区域经济林和观赏林的主要树种，在生态调节、农林经济发展等过程中发挥重要作用。鹅掌楸体胚再生技术实现了从胚性愈伤、球形胚、鱼雷胚到成熟子叶胚等过程的转变，但关于鹅掌楸体胚发生过程的分子基础尚没有报道。.本研究采用iTRAQ蛋白质组学技术和生物信息学方法分析了体胚发生过程每个时期间蛋白质谱的变化，鉴定出体胚发育过程中每个阶段之间差异表达的蛋白质，以及每个阶段特异表达的蛋白质；同时，分析了高浓度2,4-D与低浓度的2,4-D培养条件下非愈伤组织（NES-1与NES-2）之间的蛋白质谱变化；并分别比较了继代保持培养基Ⅰ保持胚性愈伤（ES1）与不同浓度2,4-D培养条件下非愈伤组织之间蛋白质谱变化。研究结果显示体胚发生过程从ES1发育到ES2阶段，检测到189个差异表达蛋白质，互作网络分析发现差异蛋白质主要参与到细胞组织结构，单糖代谢，光呼吸等过程；ES2发育到ES3过程中检测到209个差异表达蛋白质，其参与的互作网络主要有光刺激，种子萌发，种皮发育，转录后基因表达调控，叶绿体融合等；从ES3发育到ES4阶段鉴定到240个差异表达蛋白质，蛋白质互作网络分析发现与繁殖器官发育、茎发育、种子萌发、激素应答、物质转运，及脂类定位等相关的活动参与到这个发育阶段；从ES4发育到ES5过程共检测到197个差异表达蛋白质，主要涉及到茎的发育，染色体组织，线粒体运输，核糖体发生，蛋白体组装等代谢活动过程；在ES5发育到ES6过程中检测到228个差异表达蛋白质，主要涉及到胚后发育，种子脂肪体发生，叶片老化等。非胚性愈伤组织与胚性愈伤组织之间差异表达蛋白主要涉及到细胞器的形成、组织和器官的发育等。从上述分析发现鹅掌楸体胚从胚性愈伤到子叶胚的发育过程是伴随着各个组织、器官的发育与形成、细胞器的形成，以及与代谢相关调控形成而来的，且每个发育阶段代谢活性的出现有较高的关联度和次序。研究结果清晰显示出体胚发育过程已经孕育了细胞器、细胞机构、组织、器官的定位和形成，以及各种代谢活动的精细调控途径。.本项目研究阐述了鹅掌楸体胚发生过程每个阶段发育的分子机理，有助于深入理解通过鹅掌楸体胚发生技术实现林木树种快繁的分子基础，可以有助于将来进一步提高林木树种体胚再生效率提高了研究基础。