大额牛朊蛋白基因（PRNP）插入/缺失多态对疯牛病(BSE)抗性的分子评价

大额牛（Bos frontalis）是我国唯一云南特有的半野生半家养的珍贵畜种，其起源进化不同于家养牛(Bos taurus)，具有良好的产肉性能和早期生长速度快、耐粗饲等优点，可杂交改良我国本地肉牛提高生产性能。前期研究发现大额牛朊蛋白基因（PRNP）有较高的23bp插入和12bp插入频率，初步显示大额牛对疯牛病（BSE）有较高的抗性。本项目通过研究大额牛PRNP基因启动子23bp和第一内含子12bp的插入/缺失多态，分析各位点的频率；与其他已经报道的健康牛和BSE病牛比较，分析之间的差异；利用双荧光素酶报告基因方法评价23bp和12bp插入/缺失多态对启动子活力的影响；配合荧光定量PCR检验不同插入/缺失基因型对大额牛PRNP基因mRNA表达量的影响，从而筛选出对BSE有较高抗性的基因型或单倍体。为大额牛抗病育种提供分子标记，对提高大额牛品质和降低BSE威胁有重要的理论意义和实践价值。

为研究大额牛PRNP基因多态性与疯牛病（BSE）抗性的关系，本项目收集了国内外276头大额牛样品，按照规定的研究内容和研究方案开展了研究，主要成果如下：.1）首次克隆获得了大额牛PRNP基因编码区。鉴定了10个SNPs和1个插入/删除位点（187Del24），其中3个位点（C60T、G145和C756G）首次在牛科动物中检测并为大额牛所特有，系统进化树分析发现大额牛与瘤牛的亲缘关系最近。.2）确认了大额牛PRNP基因编码区中的寡肽重复，主要为6个数目的重复，其余均为5个数目的重复。其6肽重复的频率为0.844，5肽重复的频率为0.156。发现其多态性与疯牛病的易感性没有显著影响。.3）对大额牛PRNP基因23bp和12bp插入/缺失位点进行了鉴定和分析，首次得到大额牛23bp和12bp插入/缺失（I/D）位点的基因型频率和基因频率。其中， 23I/23I、23I/23D和23D/23D基因型的频率分别为0.844、0.129和0.027，其23I和23D的频率分别为0.909和0.091； 12I/12I、12I/12D和12D/12D基因型的频率分别为0.347、0.64和0.013，其12I和12D的频率分别为0.667和0.333。与世界各国已报道的数据进行比较分析发现大额牛12bp多态位点均具有较高的插入频率。构建了大额牛PRNP基因23bp和12bp插入/缺失单倍型，发现其中大额牛以23I-12I单倍型为主，频率为0.789；与国外BSE牛比较，初步确认大额牛具有高的BSE抗性。.4）不同基因型的大额牛PRNP基因在延髓的mRNA相对表达量有差异显著（P<0.05），初步确认非家养牛23bp和12bp I/D失多态也可能影响牛BSE抗性，性别和年龄对大额牛PRNP基因的相对表达量没有显著影响（P>0.05）。.5）通过构建4种类型的质粒和转录因子的表达载体pcDNA3.1-SP1和pcDNA3.1-RP58，发现在CKT-1和N2a细胞内pGL3-12D-23D的相对表达活力均显著（p<0.05）高于pGL3-12I-23I。说明携带12I-23I基因型的大额牛对BSE的抗性高于携带12D-23D的大额牛。.此外，我们发表论文5篇（其中SCI2篇），参加国内学术会议1次，培养硕士研究生2人，并于2014年再次获得国家自然科学基金（31460583）资助。