真武汤基于线粒体途径抑制心衰心肌细胞凋亡机理的研究

本课题根据前期大量以真武汤为基本方治疗充血性心衰（CHF）临床实践和部分实验研究为基础，提出："真武汤主要通过影响心肌细胞线粒体功能及其调控线粒体相关蛋白表达"假说，并开展体内外研究。通过：（1）体内实验通过实验动物心脏彩超和脑钠素（BNP）检测，证明动物模型的成功和明确真武汤的治疗效果；通过电镜观察，流式细胞仪检测等证明真武汤能抑制心肌细胞的凋亡，包括增加心肌线粒体的数量和提高心肌线粒体功能；（2）体外通过流式细胞仪和TUNEL检测等证明真武汤能抑制心肌细胞的凋亡，罗丹明123(rhodamine 123)荧光染色研究真武汤对线粒体膜电位的影响；（3）体内外通过免疫荧光和免疫印迹法等探讨真武汤抑制心肌细胞凋亡中，真武汤与胞浆中的Bax转位到线粒体及其上游蛋白p53,Sirt1的关系，明确真武汤治疗充CHF的分子机制，丰富中医温阳利水的治法，同时为真武汤中药治疗CHF提供理论依据。

目的：通过体内外实验观察真武汤对心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体功能、细胞凋亡、左室重构及心功能的影响，来探讨真武汤治疗心力衰竭的作用机理。.材料与方法：.体内实验：取80只雄性Wistar大鼠，随机抽取10只为对照组，对余70只结扎前降支近端并结合力竭式游泳复制心力衰竭动物模型，将存活的50只随机分为模型组、西药组、真武汤高中低剂量组，卡托普利为对照药。灌药15天后，用彩超测大鼠心脏FS、EF值；ELISA方法测定大鼠血清BNP、TNF-α等；Western方法测定心肌bcl-2、bax、caspase-3、sirt1、AngⅡ、ALD、AT1、小G蛋白、IL33、ST2蛋白的表达；电子显微镜观察心肌细胞的超微结构。.体外实验：正常wistar大鼠灌服真武汤和卡托普利， 7天后腹腔静脉取血，分离血清备用。取1-3天龄的Wister大鼠，将左心室剪成1mm3大小，0.06%胰酶消化制成细胞悬液，进行培养。分4组为正常组，模型组，西药组，真武汤组，对后3组用AngⅡ造模。采用免疫荧光测线粒体膜电位变化，AO/EB、TUNEL分析、流式细胞检测观察细胞凋亡情况；Western方法测定bcl-2、bax、caspase-3、sirt1蛋白表达。.结果：体内实验 模型组较正常组FS、EF值明显下降，而真武汤、西药组较模型组均有不同程度上升；血清BNP、TNF-α、CNP、IL-6、ALD、AngⅡ、MMP-9、sST2、Galectin-3、HSP70、小G蛋白较正常组明显升高，TIMP-1明显降低，真武汤、西药组较模型组BNP、TNF-α、CNP、IL-6、ALD、AngⅡ、MMP-9、sST2、Galectin-3、HSP70、小G蛋白均有不同程度降低，TIMP-1升高；模型组较正常组心肌组织bax、caspase、、AngⅡ、ALD、AT1、小G蛋白、IL33、ST2蛋白表达增加，Bcl-2、sirt1表达降低，真武汤组、西药组较模型组bax、caspase-3、AngⅡ、ALD、AT1、小G蛋白、IL33、ST2蛋白表达降低，而Bcl-2、sirt1表达升高。电镜观察模型组与正常组相比, 线粒体明显肿胀, 部分呈空泡状, 嵴变疏变短,肌丝断裂、排列紊乱,闰盘消失。真武汤、西药组与模型组比较, 心肌超微结构均有不同程度的改善。.体外实验：模型组较正常组心肌细胞线粒体膜电位明