PP2A在低温携氧机械灌注改善边缘供肝质量中的作用及机制研究

Liver transplantation is the most effective treatment to cure the end-stage liver disease. Till now, the core problem in liver transplantation is how to resuscitate the injured liver graft from warm and cold ischemia/reperfusion injury, especially for the liver with cold ischemia time more than 12 h (marginal liver graft). In our preliminary study, we established the SD rat liver hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) system, we found that DCD liver underwent 1 h of HOPE and 12 h cold storage can improve postoperative survival rate and inhibit the activity of protein phosphatase 2A (PP2A). However, the molecular mechanisms is not fully elucidated. PP2A could mediate dephosphorylation of eNOS(T495) and Drp1(S656). The aim of this study will be focused on organ preservation method for marginal liver organs and the molecular mechanism of HOPE, including the improvement the liver quality by inhibiting hepatic cell apoptosis and inflammation, through inhibition of PP2A dephosphorylaed Drp1 and eNOS. The results will fully reveal how does HOPE improve marginal liver organs quality and its molecular mechanism, providing valuable method to expend organ pool to rescue the patients on waiting list.

肝移植是治疗终末期肝病的唯一方式。如何有效地维护边缘供肝质量和修复肝脏损伤是目前亟需解决的核心问题，特别是对于冷保存大于12 h的肝脏（边缘供肝）。低温携氧机械灌注（HOPE）可以延长边缘供肝术后生存率。然而HOPE是如何提高边缘供肝质量的分子机制目前尚不完全明确。本课题预实验发现，HOPE可以抑制蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）活性。而PP2A可以去磷酸化线粒体分裂蛋白（Drp1）和一氧化氮合酶（eNOS）抑制细胞凋亡。本课题将采用自主改装的低温携氧机械灌注系统探讨一种全新保存边缘供肝的方法和HOPE抑制边缘供肝凋亡和炎症的分子机制，即HOPE通过抑制PP2A表达，减弱Drp1和eNOS蛋白去磷酸化，减轻边缘供肝凋亡和炎症，从而改善质量。研究结果将全面揭示HOPE改善边缘供肝质量的分子机制，为扩大供体池提供了有效的方法和有力的理论依据，减轻临床供肝缺乏的现状，为肝移植等待患者带来福音。

目的：肝移植是治疗终末期肝病的最佳选择，而器官短缺促使心脏死亡（donation after circulatory death, DCD）供肝大量应用于临床。目前最常用也是最方便经济的供肝体外保存方式仍是静态低温冷储存（static cold storage, SCS）。移植前多种原因会导致供肝冷保存时间延长损伤肝脏功能，影响肝移植预后。为此，我们拟通过基因干预手段，探究长时间冷保存对DCD供肝造成损伤的机制，并从动物及细胞水平验证蛋白磷脂酶2A（protein phosphatase 2A）在其中的作用。.方法：首先建立大鼠DCD模型获取肝脏，分别冷保存12h及24h，应用体外常温灌注系统评估肝脏功能，并检测PP2A，线粒体分裂蛋白Drp1，内质网应激损伤效应蛋白CHOP以及凋亡标记蛋白caspase3，caspase9，Bcl-2，Bax等的表达变化情况。之后采用AAV8病毒转染及特异性药物抑制剂分别对PP2A及线粒体分裂和内质网应激进行干预，分析长时间冷保存导致肝脏损伤过程中的具体调控机制。并通过RNA测序方式检测PP2A的干预对DCD肝脏中损伤通路的调控情况。.结果：（1）RNA测序结果显示DCD肝脏组织中凋亡调控通路表达升高，干扰PP2A使肝脏组织内凋亡调控通路及应激反应通路基因表达下降。（2）长时间冷保存加重DCD肝脏损伤，表现为体外灌注液中ALT、AST指标明显升高，肝脏切片病理损伤评分增加，细胞凋亡增加。蛋白检测显示PP2A，Drp1，CHOP表达升高，凋亡标记蛋白caspases，Bax表达升高。线粒体损伤加重，细胞色素c向细胞质释放增加。（3）干扰PP2A表达缓解了DCD肝脏损伤，表现为损伤评分降低，ALT，AST指标降低，细胞凋亡水平降低。蛋白检测显示PP2A表达降低后Drp1、CHOP表达同样下降，同时凋亡相关标记蛋白caspases表达降低。线粒体损伤及细胞色素c释放减轻。（4）抑制线粒体分裂蛋白Drp1减轻内质网应激水平，抑制内质网应激不影响Drp1的表达。.结论：在长时间冷保存造成DCD肝脏损伤的过程中PP2A表达增加使线粒体异常分裂增加，在释放包含细胞色素c在内的损伤因子同时诱发内质网应激，导致肝细胞凋亡损伤肝脏功能。而抑制PP2A可改善供肝功能，为肝脏维护提供新的靶点。