细胞表面受体及复合物的原位电镜结构研究

Cell surface receptors and their complexes are critical for mediating the interactions between cell and environment. These receptors usually contain multiple domains and have multiple conformations and oligomeric states on cell membrane. Current information about these receptors largely comes from the isolated or expressed proteins, therefore may not represent the authentic mechanisms in situ. However, due to the current technical limitations, it is still quite challenging to study the structures of these molecules directly on membrane. Recently, three-dimensional(3D) electron microscopic reconstruction has becoming a powerful tool to visualize the 3D structures of macromolecules. Based on our previous research and also the experiences on 3D electron microscopy, our goal in this application is to modify and optimize the preparation and labeling of receptor samples to preserve the in situ information and reconstruct the 3D models by electron microscopy, hence revealing the mechanisms of the receptors and their complexes on membrane.

细胞表面受体及复合物是细胞与环境进行物质和信息交流的重要媒介，具有重要的生理学功能。在结构上，表面受体通常具有多构象、多结构域、多聚集态以及膜定位等特征，这给相关的结构研究带来很大困难。由于技术手段等方面的限制，目前有关表面受体的结构信息大多基于体外表达的结构研究，因而对其功能机制的理解还有很多不足和盲点。随着近年来电镜三维重构等技术的发展以及仪器设备的进步，为生物大分子的原位结构研究提供了契机。本申请的目标就是在实验室已有的研究体系和技术经验基础上，针对表面受体及其复合物的特点，通过改进和优化细胞受体样品的制备和标记等方法，并结合电镜三维重构技术，摸索一套有效地研究细胞表面受体及复合物原位结构的方法体系，以获得相关的原位信息，进而深入阐释其功能机制。

细胞表面受体是细胞与环境进行物质和信息交流的重要媒介，具有重要的生理学功能。并且这类受体通常具有多构象、多结构域、多聚集态以及膜定位等特征，给相应的结构研究带来较大困难。目前有关表面受体的结构信息大多基于体外表达的研究体系，对其功能机制的理解还有很多不足。由于近年来电镜三维重构等技术的发展，为生物大分子的原位结构研究提供了契机。本课题针对细胞表面受体及其复合物的特点，通过改进和优化细胞受体样品的制备和标记等方法，并结合电镜三维重构技术，摸索了一套较为有效地研究细胞表面受体及复合物原位结构的方法体系，以获得相关的原位信息，进而深入阐释其功能机制。在课题执行期间，我们选取了细胞粘附分子（包括DSCAM和Sdk等）为研究目标。这类粘附分子广泛参与细胞的生长迁移、组织发育、器官形成等生理过程，尤其在神经网络的形成和调控中扮演重要角色。但过去一直缺乏其介导的细胞粘附界面的原位结构信息，因而这类分子的原位机制还是空白。研究中，我们通过建立一套包括荧光显微镜、高压冷冻、光电联合、超薄切片、电子断层成像的方法体系，并结合生化和分子生物学等多种手段，研究了其在细胞界面的组装模式，获得了细胞粘附界面的原位结构模型。这也是首次直接获得粘附分子的原位结构模型。在DSCAM和Sdk的原位结构中，我们发现了其胞外段可以分为不同功能区，并具有不同的蛋白或膜结合特性，同时还可能形成特定的组装模型，这对于理解它们的功能机制具有重要意义。由于目前已知的该类IgSF粘附分子数量众多，广泛参与了很多生物路径，因而本课题获得的细胞粘附模型对理解其介导的细胞相互作用具有普遍意义，尤其为研究神经网络的形成和调控提供了直接的结构生物学模型。与此同时，本课题通过方法学上的改进和优化，包括样品制备和保存、电镜与光镜联用等方法，建立了一套较为实用的针对细胞表面受体的原位结构研究体系，为今后深入理解受体的原位机制提供了有效的工具。