多种携带治疗基因和特异性配体的靶向性羟基磷灰石纳米载体对哺乳动物内耳的转染及保护作用研究

2006年国家统计局调查显示，我国听力残疾人数2004万，居全国残疾人总数的第二位，且每年新增聋儿3万余名；预防聋与听力减退（PDH）已成为全球的共同行动。课题组近10年来在连续两项国家自然科学基金和数项省部级基金资助下，用羟基磷灰石（HAT）纳米材料作为内耳基因治疗载体的研究取得多项阶段性进展。为进一步提高HAT纳米载体的转染效率，拟用聚乙二醇改善现有纳米载体的表面特性，再连接不同的靶向配体和相应的治疗基因，研制4种可选择性结合特定内耳细胞的靶向HAT纳米载体系统。本项目分6项实验，通过4种内耳病理模型，采用形态学研究、听觉电生理和平衡生理检查、细胞与分子生物学试验等方法，于体内、外观察和评价不同载体系统在不同实验模型中的转染效率和治疗作用；同时对所有新研制的靶向载体进行体内、外安全性试验。该项目的实施，可望大幅提高非病毒载体的转染率，形成具有自主知识产权的研究成果和新型基因治疗产品。

1、项目背景和主要研究内容.近10多年的研究表明，内耳基因治疗策略可能是治疗致残性感觉神经性耳聋的一个有效的途径，但缺乏有效和安全的基因治疗载体是这一技术进入临床应用的重要障碍。本项目的主要目的，是在前期研究的基础上通过改良纳米羟基磷灰石的结构和制备工艺（重点是纳米载体的表面处理），研发一种低毒且具有较高转染率的新型靶向性非病毒基因转染载体，并在体内外检测其功能和安全性。.2、重要结果、关键数据及其科学意义.课题组基本完成项目研究计划。.⑴ 新研制的双层PEI-PEG结构包裹HAP核心的新型载体系统在转染率和细胞毒性方面均取得了超出我们预期的突破性进展（转染率在60%～80%之间，最高者达80%以上、细胞毒性低于商品脂质体Lipo2000），现正申报国家发明专利（专利申请号：201510799147.6）。这一突破性进展说明本项目最核心的任务已经完成。在研究计划以外，还发明了一种在常温常压条件下制备纳米羟基磷灰石载体的新方法——快速沉淀法制备CaP（另一种形态的羟基磷灰石颗粒），并完成体外安全性试验，发明专利申请正在递交过程中。科学意义：用无机纳米颗粒经适当的表面修饰后，是可以达到很高的有实用价值的转染率的，有望获得新型的安全、高效的基因治疗载体。而且，有可能成为现行商品脂质体的一种替代产品。.由于申报国家发明专利，主要研究成果的论文发表将推迟到今后1-2年。.⑵ 已建成4种内耳损伤的动物模型，并建立了稳定的听功能检测体系。.⑶ 实现了在小鼠和大鼠离体螺旋神经元及囊斑组织中的基因转染，说明我们构建的载体是有功能的。.⑷ 已构建用特异性结合内耳毛细胞和神经元上trkC的肽段作为配体，用抗凋亡蛋白XIAP作为治疗基因的靶向载体系统。