耳蜗螺旋神经元铅毒性损伤的机制及羟基磷灰石纳米基因转染的保护作用研究

At present, the situation of heavy metal (lead) pollution in China is very serious, and the lead poisoning can cause or aggravate human hearing disorders. Our previous studies found that lead exposure can induce neonatal rats' cochlear spiral ganglion neurons (SGN) apoptosis, but neither inner hair cells nor outer hair cells in cochlear basilar membrane appeared obvious damage. However, the detailed mechanism is not clear. Besides, the studies on hydroxyapatite nanoparticles (nHAT) as a gene vector for inner ear gene therapy has made many progress in our group. Based on the previous studies, this project will observe the differential expression of related genes of apoptosis, oxidative stress and autophagy in SGN after lead exposure by means of RT-PCR array and western blot, in order to reveal the probable mechanism of SGN injury induced by lead exposure. This project will also investigate the effect of long-term lead exposure on hearing function of rats and analyze the relationship between lead exposure and SGN damage. Meanwhile, we will transfect the therapeutic genes mediated by modified nHAT into SGN in vivo and in vitro, in order to assess transfection efficiency of vector-gene compound in SGN and protective effect of transfection on lead-induced SGN injury.

目前，我国重金属铅污染形势十分严峻，铅中毒可以引起或加重人类的听力障碍。本课题组前期实验发现铅暴露可以引起新生大鼠耳蜗螺旋神经元（SGN）凋亡，而对基底膜的内外毛细胞无明显破坏作用，其具体机制不详；同时，本课题组前期用羟基磷灰石纳米颗粒（nHAT）作为内耳基因治疗载体的研究取得多项阶段性进展。本项目拟在前期研究基础上，通过观察铅暴露所致SGN损伤过程中凋亡、氧化应激及自噬相关基因和蛋白的差异性表达从而揭示SGN铅毒性损伤的可能机制；并观察长期铅暴露对大鼠听力的具体影响及铅暴露与SGN损害程度的相关性分析；进一步在体内外实验中应用改良型nHAT载体介导相关治疗基因转染SGN，评估载体-基因复合物在SGN中的转染效率及对SGN铅毒性损伤的保护作用。

铅中毒可以引起或加重人类的听力障碍，但是具体机制不明确。本项目在前期研究基础上，通过观察铅暴露所致SGN损伤过程中凋亡、氧化应激及自噬相关基因和蛋白的差异性表达从而揭示SGN 铅毒性损伤的可能机制，结果发现铅暴露4h后，尽管SGN的形态未发生改变，但SGN组织中已有865个基因上调，143个基因下调，共筛选出FOXO signaling pathway, Axon guidance, TNF signaling pathway, MARK signaling pathway等多条信号通路。这些通路可能与铅毒性所致SGN损伤机制有关，尚需进一步验证和研究；本课题组还观察了持续3月铅暴露对大鼠听力的影响及铅暴露与SGN损害程度的相关性分析，结果发现成年豚鼠血铅浓度在铅暴露2周时就已经到达到并基本稳定维持在高浓度水平；心脏、肝脏及肾脏中铅浓度在1月时明显升高并且一直维持高位水平；脑干组织中铅浓度在2月时才开始明显升高，而耳蜗铅浓度在3月时才出现轻度增高。DPOAE检测发现在2周、2月及3月时各频率DPOAE的振幅无明显变化，耳蜗基底膜铺片及神经纤维观察时发现各组的耳蜗内外毛细胞均无明显破坏和缺失，但3月时耳蜗的外周神经开始出现破坏，数量出现减少；虽然各组耳蜗蜗轴内SGN的形态也明显改变，但SGN数量有下降趋势。由此说明在铅暴露3月内，耳蜗内仍未出现明显的铅聚积效应，此时铅暴露对耳蜗的内外毛细胞听功能无明显影响，但可以引起耳蜗神经系统的病理改变。click诱发的ABR检测时发现所有时间点的ABR阈值无明显变化，然而在2月时III波振幅出现减小；3月时III波振幅减小、III波潜伏期延长，并且I-III波的潜伏期有所延长，检测脑干组织中自噬相关蛋白的表达发现ATG5、ATG6、LC3B等自噬相关蛋白表达有增加趋势。说明铅暴露后对听觉系统的毒性主要靶点可能在听觉神经系统中，而非耳蜗内外毛细胞本身。为尝试内耳基因转染，课题组尝试采用慢病毒携带XIAP基因经完整圆窗膜转染成年豚鼠，发现慢病毒成功转染豚鼠耳蜗，以底回毛细胞及SGN转染效率最高，该方法为后期探索内耳基因治疗提供了一条可能的方法。