Osteocalcin/MiR-133a参与维生素K"促分化、抗凋亡"机制及其在预防激素型股骨头坏死中的作用

In the background of corticosteroid-induced osteonecrosis of the femoral head (ONFH), the expression of osteogenic cytokine osteocalcin is downregulated. Vitamin K can regulate the carboxylation of osteocalcin, and MiR-133a plays an important role in the functionalization of osteocalcin. Our preliminary results showed that osteogenic differentiation of BMSC could be promoted in vitro by vitamin K treatment. Moreover, cellular apoptosis could be prevented in corticosteroid-induced ONFH. We hypothesize that osteocalcin/MiR-133a is critical for promoted differentiation and inhibited apoptosis when osteogenic precursor cells are treated by vitamin K. The promoted-differentiation and anti-apoptosis property of vitamin K is fundemental for the prevention of corticosteroid-induced ONFH. To verify our hypothesis, hypoxia will be used to mimic pathologic condition of ONFH. Methods of RNAi, MiR-133a sponge technique and so on are employed to reveal the role of osteocalcin/MiR-133a in promoted differentiation and inhibited apoptosis of vitamin K-treated osteogenic precursor cells in vitro. Furthermore, animal model of corticosteroid-induced ONFH will be designed for the investigation of preventive effects of vitamin K and osteocalcin/MiR-133a expression, through Micro-CT and in situ hybridization techniques.The current research can reveal the basic mechanism and the effect of vitamin K in the prevention of corticosteroid-induced ONFH in multiple aspects through the osteocalcin/MiR-133a pathway.

激素型股骨头坏死发生过程中，成骨细胞分化因子osteocalcin(OCN)表达显著下降。维生素K(VK)调节OCN羧基化过程，MiR-133a在OCN功能化过程中发挥了重要作用。我们预实验发现VK可在体外促进骨髓间充质干细胞(BMSC)的成骨分化;还可预防糖皮质激素诱导的细胞凋亡。为此，我们提出假说：OCN/MiR-133a在VK对骨前体细胞"促分化、抗凋亡"中发挥重要作用，为VK预防激素型股骨头坏死奠定了基础。为验证此假说，我们设计了体外模拟乏氧的病理条件，采用RNAi,MiR-133a sponge技术等研究OCN/MiR-133a在"促分化、抗凋亡"中的作用。进而通过股骨头坏死动物模型的前瞻性预防实验，利用Micro-CT,免疫杂交技术等观察OCN/MiR-133a与股骨头坏死的预防结果。本研究通过OCN/MiR-133a途径，多层面研究VK预防激素型股骨头坏死的理论基础和结果。

激素性股骨头坏死的发病机制研究认为，糖皮质激素的直接作用会诱导骨形成细胞和血管形成细胞增殖、分化障碍，促进细胞凋亡，从而使得骨稳态失衡。激素对血管的直接作用带来血管密度下降、渗透性增加、组织的有效灌注减少(间接作用)。维生素K可以促进osteocalcin羧化，在促进骨形成中可能发挥了重要作用。维生素是临床常用药物，已知它参与骨代谢，但维生素K在激素性股骨头坏死的预防和机制研究中尚无前例。. 我们以骨髓间充质干细胞(BMSC)和成骨细胞MC3T3-E1为研究对象观察激素及维生素K2对细胞增殖和分化能力的影响。研究发现，激素明显抑制增殖并促进其凋亡，而联合应用维生素K2后，细胞增殖能力明显提高，同时，维生素K2对激素导致的细胞凋亡有明显的保护作用。Western Blotting、碱性磷酸酶活性检测、Elisa 及实时定量PCR等检测证实，联合应用维生素K2能明显促进激素干预的BMSC的Runx2、ALP及OCN 的表达。体内试验，激素联合维生素K2处理组大鼠股骨头坏死发生率明显低于激素组，且联合应用维生素K2组大鼠股骨头骨密度，骨小梁体积，结构模型指数，骨小梁数量及厚度等统计学指标均优于激素组大鼠。. 为了进一步证实VK2对激素型股骨头坏死的保护作用，我们还探索了激素及维生素K2对血管内皮细胞及股骨头血供的影响。我们采用血管内皮细胞系EAhy926为主要研究对象，研究发现，激素明显抑制血管内皮细胞成管能力并促进血管内皮细胞的凋亡，而维生素K2对激素导致的内皮细胞凋亡保护作用明显且提高了内皮细胞体外成管能力及成管相关蛋白的表达。同时，体内试验显示，激素组大鼠股骨头血管体积及血管体积/股骨头总体积较正常组明显降低，而预防性应用维生素K2明显提高了大鼠股骨头血管体积及相应比值。. 最后，我们对miRNA-133a在VK2成骨调节中的作用进行了探索，通过慢病毒转染技术在BMSC细胞中过表达miRNA-133a，并采用VK2进行干预，我们发现miR-133a过表达明显抑制了BMSC的成骨分化，而VK2在促进正常BMSC成骨的同时，降低了正常BMSC中miR-133a的表达，另外，VK2还能明显促进miR-133a过表达BMSC中成骨相关蛋白的表达。