促性腺激素干预在卵巢玻璃化冻存中的抗凋亡及促移植后血管重建的作用

冻存卵巢的自体移植正在成为保存青年女性癌症患者生育力的一个策略，但冻存损伤和移植后缺血缺氧损伤成为影响该技术应用的世界性难题。研究显示,卵巢移植后给予宿主促性腺激素(Gn)干预在提高卵泡存活的同时,却造成了卵巢储备消耗。本研究组前期工作表明,Gn体外短暂干预可使小鼠移植卵巢血流灌注时间提前、绵羊冻存移植卵巢卵泡存活率提高；干预后凋亡抑制因子survivin剪接异构体高表达。故本研究拟对小鼠及人卵巢组织进行玻璃化冻存过程至移植前的Gn干预,通过对survivin、VEGF、bFGF及受体表达、卵泡细胞间对话通道蛋白及凋亡蛋白的表达、卵泡活力、移植后的血管成熟过程、生育力及卵巢储备状态检测,探索冻存及移植前Gn干预的抗凋亡、促血管生成效果和相关机制。通过对Gn诱导的高表达survivin剪接异构体的细胞生物学行为研究,确定其在凋亡与增殖中的作用,为Gn干预从冻存源头提高卵巢移植效率提供科学依据

对于面临卵巢功能衰竭的患者来讲，如需要接受放疗与化疗群体，卵巢皮质玻璃化冻存后是最有效的卵巢功能保护途径，尤其是对青春期前儿童，因为冻融后移植不但能够保存生育能力，且可回复生殖内分泌功能。然而，冷冻及解冻后卵巢无血管吻合移植会导致卵巢冷冻损伤及缺血缺氧损伤，使移植卵巢功能寿命有限。故建立有效的血供是提高冻融卵巢移植存活率的关键。FSH在卵泡发育过程中具有抗卵泡凋亡及促血管生成作用，因此，本研究目的是探索卵巢玻璃化冻融过程中最佳促性腺激素干预的浓度、程式及对无血管吻合移植后的促血流再通的相关机制。方法：以4周龄C57BL/6J 卵巢为供体，通过组织学、免疫组化技术、western-blot 、Real-Time PCR、卵巢移植、荧光血管灌注及本交实验摸索最适体外干预浓度和最佳干预程式，并比较FSH与LH干预的效果，分析对生育力的影响。结果：①0.3IU/ml HMG、0.3IU/ml FSH及0.3IU/ml LH可维持体外培养卵巢的卵泡数目，提高VEGF及其抗凋亡因子，加速移植卵巢的血流贯通。②卵巢玻璃化冻融中，0.3IU/ml FSH全程干预效果优于冻存前干预与解冻后干预的效果；③FSH的有效干预是通过上调FSHR、卵泡Cx37、Cx43、VEGF/VEGFR2、survivin和下调凋亡执行蛋白active caspase3而提高卵泡存活率。④通过高表达PCNA, Angpt-2、Integrinβ3、Kindlin-2，使移植48h的卵巢高表达与血管生成密切相关的MMP-2、CD31，增加移植卵巢48小时的血流灌注；⑤FSH干预下的冻融卵巢移植6个月时的血清E2、妊娠率与产仔数干预组明显高于非干预组。⑥与FSH相比，LH干预下的卵巢玻璃化冻融有较高的上调血管生成相关因子及卵泡存活因子的功能，但首窝产仔数两组间并无差异。FSH+LH在小鼠卵巢玻璃化冻融过程中的抗卵泡凋亡作用优于单独FSH干预效果，但弱于LH。⑦成人卵巢皮质冻融后，采用0.3IU/ml FSH全程干预玻璃化冻融成人卵巢皮质后异种移植，呈现出高于非干预组的存活卵泡及新生血管。结论: 小鼠卵巢玻璃化冻融过程中单独的FSH、LH及两者联合干预均可维持较高的存活卵泡数，无血管吻合移植后能加速血管生成，提高生育功能。其机制与上调抗凋亡及血管生成相关因子、下调凋亡执行因子有关。