FBXW7与EBP1异构体的差异性相互作用调控三阴性乳腺癌发生发展

Triple negative breast cancer is one of the most malignant tumors in women and lack of effective therapeutics. Our previous report showed that lower FBXW7 expression is significantly correlated with both overall and disease-free survivals only in basal-like breast cancer. One newest reported confirmed that FBXW7 level is lowest in TNBC compared with other molecular types of breast cancer. Our preliminary data also showed inhibitory effects of FBXW7 on proliferation and migration/invasion of TNBC and basal-like breast cancer cells. All of those indicated that FBXW7 may play more important roles in the development and progression of TNBC. Our preliminary data also showed FBXW7 targeted and ubiquinited the long isoform of EBP1, EBP1 P48, which was shown to promote the proliferation and migration/invasion of TNBC cells in vitro, however, FBXW7 cannot degrade the other isoform of EBP1, EBP1 P42, instead, P42 stabilized FBXW7 and enhanced degradation of FBXW7 oncotargets. Taken together with others' reports, we postulated that the two isoforms of EBP1 play oncogenic and suppressing roles respectively in the development and progression of TNBC, further, FBXW7 interacts with the two isoforms of EBP1 distinctly, FBXW7 degrades EBP1 P48 to inhibit its oncogenic function, EBP1 P42 binds to FBXW7 to enhance its suppressor functions. To validate our preliminary data and test our hypothesis we planned to 1. Verify the functional roles of FBXW7 in the development and progression of TNBC; 2. Discriminate the differential roles and biological significances of EBP1 isoforms in TNBC; 3. Elucidate the distinct interactions among FBXW7 and EBP1 isoforms; 4. Finally examine the correlations among FBXW7, EBP1 isoforms and clinical characteristics in TNBC patients. The successful accomplishments of this project will establish the EBP1 P42-FBXW7-EBP1 P48 networking in development and progression of TNBC and will further our understanding of TNBC, which will be mechanistic fundamentals for developing new targeted therapy for TNBC.

我们发现虽然乳腺癌中抑癌基因FBXW7表达降低，但该变化只与三阴乳腺癌（TNBC）患者的无病和总生存期相关，并且FBXW7能抑制TNBC细胞的增殖和迁移、泛素化降解ErbB3结合蛋白EBP1的P48亚型，但不能降解P42亚型，反而P42可能增强FBXW7的功能。我们推测FBXW7在TNBC具有重要抑癌作用，EBP1两个亚型在TNBC中分别起促癌和抑癌作用，并且FBXW7与EBP1亚型差异性相互作用，FBXW7靶向降解癌蛋白EBP1 P48，而P42增强FBXW7抑癌功能，三者相互关联，调节TNBC的发生发展。本项目拟在前期研究基础上，从分子、细胞、小鼠和临床水平，①明确FBXW7、EBP1异构体在TNBC发生发展中的作用；②阐明FBXW7、EBP1不同亚型间相互作用网络及分子基础；③并在TNBC组织中分析FBXW7、EBP1不同亚型、临床特征之间的相关性，为研发TNBC的靶向治疗提供思路。

EBP1有两个亚型，分别为P48和P42，P48作为癌基因主要促进肿瘤发生和进展，而P42通过抑制细胞生长发挥抑癌基因作用。然而，EBP1不同亚型发挥差异性作用的分子机制目前尚不明确。本研究中，我们在鉴定FBXW7新的靶底物过程中发现FBXW7差异性调控EBP1亚型的表达，进一步的研究表明EBP1亚型通过与FBXW7的差异性相互作用发挥不同的肿瘤生物学功能。.首先我们通过2-DE和MS技术鉴定EBP1为FBXW7靶蛋白，在分析FBXW7对EBP1的表达调控时发现FBXW7差异性调控EBP1亚型的表达。FBXW7可降低EBP1 P48的表达，而对EBP1 P42的表达没有影响。机制研究发现FBXW7通过WD结构域与EBP1 P48结合并调控EBP1 P48的泛素化降解，且FBXW7对EBP1 P48的降解依赖于GSK3β对EBP1 P48的磷酸化作用。我们在对EBP1 P48序列分析过程中发现其包含两个潜在的GSK3β磷酸化序列，分别为40-44位和88-94位氨基酸序列。通过检测FBXW7对EBP1 P48缺失突变体的表达调控，我们确定EBP1 P48通过40-44位氨基酸序列与FBXW7 WD结构域结合进而被泛素化降解。而EBP1 P42缺少N端54个氨基酸，虽然可以与FBXW7结合，但却不能被FBXW7降解。.此外，我们在研究FBXW7和EBP1 P48相互作用时发现EBP1 P48可通过促进FBXW7由细胞核向细胞质移位而反向抑制FBXW7的功能。研究报道FBXW7细胞内定位发生改变将导致一系列病理进程，因为这将影响FBXW7对下游靶底物的降解。我们研究发现EBP1 P48促进FBXW7细胞核移位后会抑制FBXW7对细胞核定位底物的降解。而对EBP1 P42与FBXW7相互作用分析时我们发现EBP1 P42可以与FBXW7的F-box结构域直接结合，而与WD结构域的结合需要FBXW7靶底物的介导，提示EBP1 P42可能与FBXW7-底物复合体有相互作用，P42能增强FBXW7与底物的结合，从而增强FBXW7对其底物的降解，EBP1 P42借此机制发挥抑癌作用。.综上，我们的研究揭示了FBXW7对EBP1亚型的差异性调控作用。本研究的完成不仅明确了FBXW7和EBP1的肿瘤生物学功能，也为探索以FBXW7和EBP1为靶标的早期诊断指标及治疗靶点提供了理论依据。