C2orf40在乳腺癌中的作用及基于TAP-MS技术的作用机制研究

抑癌基因失活及功能紊乱是导致乳腺癌发生发展的主要病理因素之一。我们前期研究观察到C2orf40的表达与乳腺癌预后密切相关，且体外高表达C2orf40及相应的条件培养液能显著抑制乳腺癌细胞增殖，但C2orf40在乳腺癌中的作用机制尚不清楚。根据相关文献和前期结果，我们推测C2orf40抑癌机制可能是以胞外分泌方式，与细胞膜蛋白相互作用而发挥其抑癌作用。本课题拟在前期研究基础上：①从分子、细胞、基因敲除动物水平系统研究C2orf40在乳腺癌发生发展中的作用和作用方式；②采用串联亲和纯化质谱分析（TAP-MS）等技术分析与C2orf40相互作用的靶蛋白，研究C2orf40抑制乳腺癌的跨膜信号转导网络；③分析人乳腺癌组织，明确C2orf40在肿瘤组织中的变化及其临床意义。旨在通过上述实验验证我们的假设，揭示乳腺癌发生发展的新机制，为下一步研究乳腺癌预后预测的新靶标和生物治疗的新策略提供依据。

抑癌基因失活及功能紊乱是导致乳腺癌发生发展的主要病理因素之一。我们前期研究提示C2ORF40 的表达与乳腺癌预后密切相关，且体外实验证实过表达C2ORF40 或者过表达C2ORF40的乳腺癌细胞培养上清能抑制乳腺癌细胞增殖，但是 C2ORF40 在乳腺癌中的抑癌作用及其机制尚不清楚。根据相关文献和前期结果，我们推测 C2ORF40抑癌机制可能是以胞外分泌方式，与细胞膜蛋白相互作用而发挥其抑癌作用。在本课题中，我们首先证实了C2ORF40表达水平与乳腺癌患者预后的相关性，高表达C2ORF40的乳腺癌患者生存时间明显延长。同时我们通过逆转录病毒技术成功建立了过表达C2ORF40或C2ORF40沉默的乳腺癌细胞系。在此基础上，我们首先利用MTT、克隆形成、细胞周期分析等实验证实过表达C2ORF40能够抑制细胞的生长及细胞周期M期的进展，同时划痕实验、matrigel和transwell实验揭示了C2ORF40在乳腺癌细胞迁移和侵袭过程的抑制作用。我们还通过沉默C2ORF40的表达水平进一步证实了C2ORF40对乳腺癌细胞增殖、迁移的抑制作用，并经裸鼠成瘤实验进一步证实了C2ORF40对乳腺癌的抑制作用。在此基础上我们探索了C2ORF40在乳腺癌表达降低的机制，通过23种乳腺癌细胞系C2ORF40基因启动子甲基化分析发现多数乳腺癌细胞系C2ORF40基因启动子存在甲基化，实验证实C2ORF40启动子超甲基化是C2ORF40在乳腺癌中表达降低的主要原因。我们同时还探索了C2ORF40的下游靶蛋白，并通过串联亲和质谱分析技术寻找C2ORF40有关的结合蛋白。串联亲和质谱分析发现、免疫共沉淀实验证实与C2ORF40相关的跨膜蛋白受体，高表达C2ORF40能抑制该跨膜蛋白下游信号通路主要蛋白的激活，依此我们认为C2ORF40是通过受体酪氨酸激酶信号途径起到抑制乳腺癌细胞增殖的作用。总之，在本课题中我们验证了C2ORF40与乳腺癌病人预后的关系，并发现C2ORF40启动子甲基化是其表达降低的原因，证实了C2ORF40抑制乳腺癌细胞增殖，迁移，侵袭的作用，并初步发现C2ORF40可能通过抑制酪氨酸激酶信号途径来发挥上述作用。