利用小分子组合诱导人造血干细胞体外扩增

In vitro culture of human hematopoietic stem cell (HSC) is a world challenge. Previous work optimized cytokines and exogenous gene expressions to expand human HSC. However none of the attempts achieved significant human HSC proliferation. Recent years, small molecules have gained popularity in manipulating stem cells. Combinatorial targeting of specific signaling pathways enables not only cellular reprogramming and trans-differentiation, but also the expansion of adult stem cells. In this proposal, we plan to screen stem cell related chemical library, and search for effective small molecule combinations that can induce human HSC expansion. The efficiency of the expansion system will be validated using in vitro colony forming assay and in vivo transplantation experiments. After the establishment of the novel HSC culture system, we will study the mechanisms of the chemical induced human HSC proliferation using single cell genomic technologies. Our work will have a long term impact on basic researches and clinical applications in regenerative medicine.

人造血干细胞的体外扩增是一项世界难题。前人利用生长因子和外源基因表达实现了人造血干细胞短期内一定程度上的增殖，然而并未实现真正意义上的体外培养。近年来，小分子化合物逐渐成为了细胞命运控制的新手段，在特定小分子组合的作用下，人们不但能够实现体细胞重编程和转分化，更能诱导成体干细胞的大量增殖。本项目拟结合申请人团队在小分子组合筛选上的前期工作，运用申请人在造血干细胞领域的知识积累和研究经验，系统性筛选促进人HSC体外扩增的干性相关小分子，寻找促进人HSC体外扩增的最佳小分子组合，并利用功能性实验验证扩增效率。申请人团队也将利用单细胞组学实验研究小分子组合诱导人HSC体外扩增的机制，解析人HSC再生与分化的相关通路。本项目力争实现人HSC的体外持续扩增，为血液系统的细胞治疗和基因治疗提供可靠的细胞来源。

人造血干祖细胞的体外培养和持续扩增一直是骨髓移植领域内的一大重要目标。近年来，小分子化合物逐渐替代生长因子和外源基因，成为了细胞命运控制的新手段。在本项目中，我们利用高通量平台系统性地筛选了186个促进人造血干祖细胞体外扩增的小分子。对于通过初筛的较优小分子，我们进一步通过调节小分子组合和浓度，最终筛选出CHIR-99021、Forskolin和OAC1（CFO）这3个小分子化合物组合可在体外最大程度地增加人造血干祖细胞的数量，实现血液干祖细胞的体外再生。一步法单细胞q-PCR实验、体外克隆形成功能实验、流式分析以及免疫缺陷小鼠体内造血重构实验都表明经过小分子化合物组合CFO处理的人造血干祖细胞干性标记基因表达增加、体内造血重建能力增强。利用自主研发的高通量单细胞测序平台（Microwell-seq）转录组分析，我们比较了原代的人类和小鼠外周血细胞，造血干祖细胞，以及免疫缺陷小鼠体内扩增的人造血干祖细胞的单细胞图谱，构建人造血干祖细胞再生与分化的分子调控模型。在Microwell-seq V1.0的基础上，我们通过结合预标记的方法提高单次实验的细胞通量，建立超高通量单细胞转录组分析平台Microwell-seq V2.0和单细胞染色质可及性分析平台Microwell-ATAC-seq V2.0，并应用于大规模高通量的小分子化合物筛选实验。最后，我们利用高通量单细胞转录组分析发现小分子化合物组合CFO作用是通过激活转录因子HOXA9和GATA2以及AKT-cAMP信号通路而调节人造血干祖细胞的自我更新。综上所述，本项目通过高通量筛选寻找到最佳小分子组合CFO可实现人造血干祖细胞的体外扩增，并从单细胞水平解析人造血干祖细胞自我更新的内在分子调控机制，为骨髓移植基础科学研究提供新见解，为临床上血液系统的细胞治疗和基因治疗应用提供新方案。