苏云金芽孢杆菌杀蝗虫的作用机理研究

苏云金芽孢杆菌（Bt）作为一种重要的杀虫细菌在害虫生物防治中发挥了极其重要的作用。蝗虫是一种世界性的重大农业害虫，但国内外有关Bt杀蝗虫的报道很少，有关Bt 杀蝗虫作用机理的报道更是空白。本项目拟通过采用X-射线衍射、免疫荧光、受体配基杂交、体外结合实验、表面胞质共振、基因突变或缺失等技术和方法，研究杀蝗虫Bt杀虫蛋白质的结构特征及其与功能之间的关系，阐明影响Bt杀蝗虫活性的关键因素，揭示 Bt 杀虫蛋白质在蝗虫肠道中的降解过程、作用部位、受体蛋白类型和作用方式等作用机理。这对于较全面地了解Bt的杀虫机制、拓宽Bt的研究视野、发掘杀蝗虫等Bt特异性新菌株及杀虫基因资源均具有十分重要的意义，预期成果可望填补国内外在Bt杀蝗虫作用机理研究方面的空白，为构建高效杀蝗虫Bt工程菌和Bt杀蝗剂的研制以及抗蝗虫转基因植物的研究等奠定良好基础。

蝗虫是一种世界性的重大农业害虫，其中东亚飞蝗在我国分布范围最广、成灾最频繁、危害最严重。苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种应用最广泛的杀虫细菌，但有关Bt杀蝗虫的报道很少。本实验室在国际上首次筛选到一株对东亚飞蝗具有特异杀虫活性的Bt菌株BTH-13，并首次从中克隆了杀蝗虫晶体蛋白编码基因cry7Ca1。本项目旨在研究BTH-13特异性杀蝗虫的作用机制，经过4 年的研究，完成预期研究目标，共发表SCI论文8篇；申请专利3项，获授权专利3项。.对东亚飞蝗中肠液降解Cry7Ca1原毒素的活性分析发现，中肠液可有效降解BTH-13菌株129 kDa的原毒素为64 kDa毒素蛋白，中肠液中活化该毒素的蛋白酶主要为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等丝氨酸蛋白酶；东亚飞蝗中肠液不同于其他昆虫为弱酸性环境，表明Cry7Cal在蝗虫中肠中可能有着不同的活化机制。免疫荧光检测及组织解剖观察发现，Cry7Ca1主要在作用于蝗虫中肠上皮层细胞组织，可引起蝗虫中肠组织明显的进展性病理学病变；体外结合及同源竞争实验表明，Cry7Ca1可与蝗虫中肠上皮细胞膜进行有效的特异性结合；配体杂交试验结果显示蝗虫BBMV上四个可与Cry7Ca1特异结合的蛋白，可能为Cry7Ca1在蝗虫中的受体蛋白。Cry7Ca1的三维结构解析发现Cry7Ca1的结构域Ⅱ与其它Cry蛋白结构域Ⅱ存在着较大差异。Cry蛋白结构域Ⅱ是毒素与昆虫中肠上皮细胞受体结合的区域，Cry7Ca1结构域Ⅱ与其它Cry蛋白结构域Ⅱ的低相似性，可能是Cry7Ca1特异杀蝗虫的原因。利用定点突变对Cry7Ca1中若干关键位点进行了功能研究，结果表明，Cry7Ca1上一些关键位点的突变可提高或降低其稳定性及杀虫活性，这些位点可能与Cry7Ca1杀虫活力密切相关。.本项目的研究成果首次解析了Bt杀蝗虫晶体蛋白质的三维空间结构，揭示了其结构与功能之间的关系及杀虫作用机理，阐明了蝗虫肠液中影响杀虫活性的主要因素，并与杀虫活性密切相关的氨基酸位点。该项研究成果填补了国内外在Bt杀蝗虫作用机理研究方面的空白，对拓宽Bt的研究视野、发掘杀蝗虫和其它未报道的目标昆虫的Bt特异性新菌株及杀虫基因资源、保护知识产权等具有重要意义，为构建高效杀蝗虫Bt工程菌和新型Bt杀蝗剂的研制与应用以及抗蝗虫转基因植物的研究等奠定了良好基础。.