粤蓝链霉菌中类SoxR蛋白的生理功能研究

转录因子SoxR在大肠杆菌中参与抗氧化胁迫的全局性调控，在铜绿假单胞菌中参与群体对环境变化的协同应答过程。榴菌素生物合成基因簇中存在类soxR基因orf20，这是目前发现的唯一一个位于抗生素生物合成基因簇中的类soxR基因，且基因簇内还存在两个可能的SoxR结合位点。粤蓝链霉菌是我们近年报道的新物种，前期我们发现该菌能产生榴菌素，并克隆测序了其生物合成基因簇，在国际上首次成功建立了榴菌素产生菌的有效遗传转化体系。本项目通过体外重组表达、电泳迁移试验、构建相关突变株、目标基因转录水平分析等，研究粤蓝链霉菌中类SoxR蛋白ORF20在榴菌素生物合成基因簇内的目标结合位点、调控的目标基因和所感应的信号分子，阐明ORF20在榴菌素生物合成过程中的作用和机制，揭示ORF20在粤蓝链霉菌中的生理功能，极可能发现SoxR 在微生物体中一种新的生理功能和作用机制。

SoxR在大肠杆菌中是一个氧化还原感应调控蛋白，类soxR基因广泛分布于多个细菌门中。随着越来越多的类soxR基因被鉴定，有关SoxR能否被氧化还原活性物质直接激活的问题一直存在争论。orf20是榴菌素生物合成基因，是目前发现的唯一一个位于抗生素生物合成基因簇中的类soxR基因，对其开展研究有助于解决这一争论。通过体外结合实验证实orf15、orf19启动子区域存在ORF20蛋白的特异性结合位点，即orf15、orf19是ORF20蛋白在榴菌素生物合成基因簇内的2个调控靶标基因；通过全基因组测序和生物信息学分析，意外地发现基因组中存在众多可能的ORF20目标结合位点。通过体外重组表达和体内基因敲除等方法证实榴菌素生物合成基因orf20对榴菌素的生物合成存在负调控效应，重组ORF20蛋白能够替代大肠杆菌SoxR参与抗氧化胁迫的调控，但在原宿主粤蓝链霉菌中并不参与抗氧化胁迫调控。研究了orf20对榴菌素生物合成负调控效应的机制，发现orf20敲除突变株中，orf15的转录表达水平在产色前突然升高的幅度大大高于野生株，高水平转录持续的时间更长，外排基因持续、高水平的转录表达，是orf20敲除突变株榴菌素的产量提高的原因。对榴菌素生物合成基因簇内的其它调控基因（orf7、orf10、orf11）进行了研究，发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因orf7并不直接参与榴菌素生物合成的调控。orf10/orf11是一个双组分系统，在榴菌素生物合成调控的信号通路中处于途径特异性转录激活基因orf9的上游，其直接调控的目标基因即是途径特异性转录激活基因orf9。