链霉菌两类亮氨酸tRNA与相关蛋白质的相互作用

tRNA is a type of classic non-coding RNA. According to the length of variable arm, tRNAs can be divided into two classes. Most of the tRNAs belong to class I tRNA with a short variable arm, and a few tRNAs have long variable arm and belong to class II tRNA. Usually, the prokaryote and eukaryote cytoplasm only contain class II tRNALeus, however the eukaryote mitochondrion contains class I tRNALeus. Two types of LeuRS catalyze leucylation of the two classes of tRNALeus, respectively. Streptomyces is a rare species containing both class I and II of tRNALeus but only one LeuRS in its cytoplasm. In the project we will study the properties of the two types of tRNALeus and their interactions with the related proteins in Streptomyces coelicolor, including investigating the tertiary structure differences between the two kinds of tRNALeus, understanding how one LeuRS could recognize two tRNALeus, finding the crucial domain in LeuRS to recognize the two kinds of tRNALeus, comparing the different recognitions of the two types of tRNALeus to modification enzymes and elongation factors, and learning the translation efficiency of the two types of changed tRNALeus in ribosome. We will also search and identify the unknown proteins which could interact with these two types of tRNALeus to investigate the new functions of the tRNALeus. Additionally, we will obtain Streptomyces coelicolor strain with knockout genes encoding class I tRNALeu and the LeuRS separately to study the interaction and function of tRNALeu and LeuRS in vivo，and to identify the crucial residues which are important for interaction.

tRNA是非编码RNA。根据tRNA的可变茎环的短和长将tRNA分为I类和II类，原核细胞中和真核细胞质中只存在第II类亮氨酸tRNA（tRNALeu）；而真核细胞线粒体中还存在第I类tRNALeu。两种亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)分别催化两类tRNALeu亮氨酰化。但在天蓝色链霉菌中兼有两类tRNALeu对应一种LeuRS。本申请将研究天蓝色链霉菌中两类tRNALeu与相关蛋白质的相互作用:研究这两种tRNALeu的高级结构的差异，如何被一种LeuRS识别，LeuRS识别两种tRNALeu的关键结构域，它们与修饰酶、延伸因子的相互识别，两种 tRNA与核糖体结合和翻译效率，发现未知的与两种tRNALeu相互作用的蛋白质，探索其新功能。构建第I类tRNALeu和LeuRS基因分别敲除的天蓝色链霉菌株，体内研究tRNALeu与LeuRS的相互作用及其功能，鉴定参与相互作用的关键残基。

tRNA可分为两类，I型和II型分别带有短和长的可变环。通常，I型和II型的tRNALeu的氨基酰化分别由其对应的亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）催化。但是，在天蓝色链霉菌 (S. coelicolor)中，存在两种类型的tRNALeu，I类的ScotRNALeu(CAA)和II类的ScotRNALeu(UAA)，却只有一种（ScoLeuRS）。我们的研究发现I类tRNALeu比II类的热稳定性差，它们都能被ScoLeuRS亮氨酰化，反应的最适条件相同。尽管ScoLeuRS与两类tRNALeu的亲和力相似，但ScoLeuRS对ScotRNALeu(UAA)比I类ScotRNALeu(CAA)具有更高的催化效率。通常tRNALeu的A73是LeuRS识别的关键核苷酸，但是在两类ScotRNALeu中A73已经不是酶的识别元件，识别子移向C74。借助于已知的大肠杆菌LeuRS和tRNALeu的复合物结构，我们突变了与A73相互作用的ScoLeuRS氨基酸残基，发现它们与酶的活力无关；而突变与C74相互作用的氨基酸残基酶活力则完全丧失。我们还发现两类ScotRNALeu可变环的个数而不是碱基类型对它们接受氨基酸的能力极为重要；ScotRNALeu(UAA)的D环和TψC环形成的三级结构对ScoLeuRS的识别更重要。我们用ScotRNALeu(UAA)基因敲除菌株在体内测定了该tRNA及其突变体对天蓝的链霉菌的次生代谢作用的影响，得到与体外一致的结果。通过不同来源的链霉菌中LeuRS的结构域的取代实验，进一步鉴定了ScoLeuRS的亮氨酸专一结构域(Leucine Specific Domain, LSD)能赋予仅催化II型ScotRNALeu亮氨酰化的链霉菌S. purpurogeneiscleroticus 的LeuRS（SpurLeuRS）亮氨酰化Ⅰ型tRNALeu的能力;鉴定出位于LSD的C端识别Ⅰ型tRNALeu的关键氨基酸残基。综上所述，我们发现了一种罕见的LeuRS对tRNALeu识别机制。在该项目的资助下，发表研究论文16篇，中文综述3篇。培养博士研究生10名，其中7名毕业并获得博士学位。一名项目组成员由副研究员晋升为研究员，获得国家自然科学基金委优秀青年科学基金资助。5人次参加国际会议给出学术报告，3位国外学者来访并给出学术报告。