腾冲嗜热厌氧杆菌自然感受态形成机制的研究

Natural competent cells permit the uptake of naked DNA through horizontal gene transfer, this process is defined as natural transformation. Natural transformation plays important role in biological evolution, biodiversity and environmental adaptability. Naturally competent organisms are found in many bacterial phyla, although the overall number of bacteria known to be naturally competent is ralatively small. The ratio of thermophiles which have natural competence and natural transformation is higher than that of the mesophiles. The molecular mechanism of the above phenomenon is not quite clear so far. During the construction of the genetic transformation system in Thermoanaerobacter tencongensis MB4, we found that T. tencongensis MB4 underwent the natural competence during all the lifecycle. To elucidate the the mechanism of its natural competence, the following works would be performed in detail in this proposal. Firstly, the analysis of geneomic informations between the known thermophiles would be performed to decide the propable genes involved in the natural competence. Secondly, the genes relevant to natural competence would be blocked through gene distruption to elucidate their functions in vivo. The transformation frequency between the wild-type and the mutanted strains would be analyzed. The transcription level of the natural-competence relevant genes in both strains would be studied. Thirdly, the traverse and the location of the fluorescence-labelled DNA through the membrane or in the cell would be observed in the mutant strains and the wild-type T. tencongensis MB4 under the fluorescent microscope. These studies would also provide novel theoretical data for the preparation of optimal competence and the construction of the efficent transformation system in T. tencongensis MB4.

自然感受态细胞通过水平基因转移主动摄取同源或异源的“裸露”DNA分子。该自然转化过程是促进生物进化、生物多样性及环境适应性的重要动力之一。在多个“门”的细菌中都发现了自然感受态的存在，但是具有该特性的细菌种类仍不多。其中，极端环境下生长的嗜热菌中具有自然感受态特性的菌种比例比常温菌中的比例要高，而其分子机制仍不清楚。我们在构建腾冲嗜热厌氧杆菌的遗传转化系统的过程中发现，该菌株在整个生长周期中都具有自然感受态。为深入揭示其自然感受态形成的分子机制，本项目将（1）通过生物信息学比较，确定腾冲嗜热厌氧杆菌中参与自然感受态形成的基因；（2）构建基因阻断突变株，以野生型为对照，分析突变株自然转化频率以及自然感受态相关基因的转录水平的变化；（3）显微观察荧光标记的DNA对突变株或野生株的跨膜动态过程和胞内定位。上述研究还将为腾冲嗜热厌氧杆菌的最佳感受态的制备及其高效遗传转化系统的建立提供理论支持。

腾冲嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）是我国科学家于 1998 年在云南省腾冲热泉内发现的杆状、革兰氏阴性厌氧真细菌。其生长温度范围为50~80℃，最适生长温度为 75℃。其基因组序列在2002年由我国科学家完成。在前期研究中发现，该菌株没有内源性质粒，很难进行外源基因的转化，因此无法进行该菌株基因功能的研究。这无疑阻碍了其特有生命机制的研究和揭示。本项目的目的在于建立T. tengcongensis成熟的遗传转化操作系统，初步揭示其自然感受态形成机制，特别是其与温度相关的环境适应机制。.本项目研究发现，该菌株在一定条件下可以形成自然感受态。经条件优化后，自然转化率可达每微克DNA（7.16±0.51）万个转化子。影响该菌株自然转化频率的因素包括DNA-细菌相互作用时间、细菌密度等，但钙离子浓度不影响该菌转化频率。对该菌株进行基因阻断来研究相关基因的功能，发现基因阻断发生的频率与培养温度明显相关，在30℃、40℃进行转化检测不到破坏子，在50℃和80℃培养条件下所得到的破坏子数量明显少于菌株适应生长的60℃和75℃;基因破坏的效率也与保温时间成正相关性，在6-8小时时得到的破坏子数最多。初步转录分析发现，推测的可能参与自然感受态形成及DNA重组的基因comEA, comEC 和recO的表达不受影响;相反，参与淀粉代谢的基因amyA和pfkA的表达在两种条件下明显不同。这说明T. tengcongensis自然感受态形成的机制非常复杂，需要更充分的基因表达试验数据来研究和揭示。为了解释其相关的分子机制，本项目对不同温度下生长的T. tengcongensis进行了初步的转录组学研究和分析。.在Illumina Hiseq 2000平台用链特异性测序研究了T. tengcongensis在50℃、60℃、75℃和80℃下的转录组，结果显示: 2408个基因在上述温度下均有表达，其中251个基因表达发生了变化，如参与细胞自适应、氧化还原、电子和金属离子转运、大分子细胞壁代谢等生物过程的基因以及氧化还原酶活性、NAD(P)H活性、电子载体活性和腺嘌呤黄素二核苷酸结等酶编码基因等。其详细的作用机制和相互关系还需要进一步的研究来揭示。..