单分子微流控操控荧光检测新方法

The study of the structure-function relation of biomolecules is important to both fundamental and application research. Compared to the typical method of structural biology, the method of single molecule fluorescence detection has unique advantages on the study of the structure-function relation of biomolecules. However, the current method of single molecule fluorescence detection has several limits about the manipulation of single molecules: disturbing activities of biomolecules, having short observation time, failing to manipulate multi-molecules simultaneously and so on. Here we propose that we can implement the technology of microfluidics to generate μm-size droplets to trap single biomolecules. Then we can manipulate the single biomolecules by controlling the droplet and realize the long-time detection of single molecule fluorescence. We would also demonstrate the practicability of this method by studying the conformational dynamics of the intrinsic disordered protein (IDP) 4.1G and the binding of it with ligands. The proposed method presents several advantages: reducing the possible interference with biomolecules, enabling the control of several molecules and observation of the interaction between these molecules, significantly extending the observation time, being easy to use and applicable on the study of many kinds of biomolecules.

研究生物大分子结构-功能关系具有重要的科学和实用意义。相比于结构生物学方法，应用单分子荧光检测技术研究上述生物学问题具有独特优势，但是现有的单分子荧光检测方法在操控分子方面具有干扰生物分子活性、观测时间短以及不能同时操控多个分子等局限性。本课题提出应用微流控技术产生微米级液滴来包裹单个或若干生物大分子，通过控制液滴实现单分子操控，同时应用荧光成像系统实现长时间的单分子荧光检测，我们还将通过研究天然无序蛋白4.1G的构象动力学以及和配体相互作用验证此方法的适用性。本课题方法的优点是：减少对生物大分子可能的干扰，能够同时操控几个分子并观测分子间相互作用，大幅度延长观测时间，易于使用并可广泛用于多种生物分子的研究。

microRNA是细胞内的内源性非编码RNA，在许多基本的生物过程中发挥着重要的调节功能，与许多人类疾病尤其是各种癌症的发生和发展有密切关系。但miRNA具有和基因组DNA显著不同的特点：如序列短、丰度低、不稳定易降解、序列同源性高等，因此miRNA的检测具有很多挑战，而单分子荧光成像方法由于具有超级灵敏度，用于miRNA检测具有显著的优势。. 本课题首先初步建立了用于操控单个miRNA等分子的微米级微流通道的加工方法，未来有望以此为基础大幅简化单分子荧光检测方法。然后本课题着重较为系统地发展了新型的单分子荧光核酸检测方法，包括应用于细胞提取液的两种单分子荧光核酸检测方法和应用于细胞原位等场景的一种信号扩增单分子荧光核酸检测方法，以及核酸修饰酶活性的单分子荧光成像检测方法，并且以肿瘤细胞miRNA标志物作为模型验证了单分子荧光检测方法的实用性，这一系列方法普遍获得了比现有传统检测方法高若干数量级的超级灵敏度和良好的选择性。此外，我们还建立了研究纳米催化颗粒机制的单分子荧光成像检测方法，具有在平衡状态测量动力学过程、能够完全测量颗粒间异质性等独特优点。 . 在本课题资助下，课题负责人共发表论文八篇，其中作为共同通讯作者在Anal. Chem.，Cell Chem. Biol.，Chem. Sci., ACS Nano, ACS Appl. Mater. Interfaces等期刊发表五篇论文，另外有一篇Front. Bioeng. Biotechnol.论文已接收.